全自動毛細管電泳儀在異常血紅蛋白篩查中的應用

許偉華，劉冬霞，龍輝，胡新年，湯美芬

(清遠市婦幼保健院優生與遺傳實驗診斷中心，廣東 清遠511515)

血紅蛋白病是一類由于血紅蛋白（hemoglobin，Hb）結構異常或合成量不足而引起的遺傳性血液病；地中海貧血是由于組成血紅蛋白的珠蛋白鏈合成量不平衡而引起貧血；異常血紅蛋白則是因為血紅蛋白的珠蛋白鏈一級分子結構異常所引起的血紅蛋白分子結構改變，如Hb S病、Hb E病等[1]。目前已發現的異常血紅蛋白有700多種，其中大多數是α鏈和β鏈的變異，并且以單個堿基的替代為主[2]。我國人群中，多數類型的異常血紅蛋白沒有明顯的臨床表現，但有少數異常血紅蛋白單獨（如Hb CS純合子）存在或復合地中海貧血（如Hb E/β-地中海貧血）時，表現為中間型或重型地中海貧血。因此，在地貧的高發地區，異常血紅蛋白的篩查及診斷十分重要。鑒定Hb的傳統方法主要有醋酸纖維膜電泳、瓊脂凝膠電泳等，但都操作過于繁瑣，費時且檢出率低。近幾年發展起來的全自動毛細管電泳（CE）高度自動化，在地中海貧血篩查中有較好的敏感性和特異性，因此被廣泛的應用臨床實驗室。

在這項研究中，我們利用全自動毛細管電泳儀對12257例標本進行了血紅蛋白分析，同時將篩查出的異常蛋白陽性標本進行了基因檢測鑒定，旨在了解全自動毛細管血紅蛋白電泳儀在異常血紅蛋白篩查中的應用價值，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年1月至2016年12月在本院門診及住院患者12257例，其中男性4902例，女性7355例，共檢出異常血紅蛋白標本232例，其中男性101例，女性 131例，年齡 14～44歲，平均年齡為29歲，并在知情同意情況下進行進一步地貧基因檢測。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 毛細管血紅蛋白電泳 法國Sebia公司生產的Capillarys2全自動毛細管電泳儀及其配套血紅蛋白電泳試劑盒CAPILLARYS HEMOGLOBIN(E)。

1.2.2 地貧基因檢測 診斷試劑盒由深圳亞能公司提供，DNA提取為廈門至善全自動核酸提取儀Lab-Aid820及磁珠法DNA提取試劑，擴增儀為伯樂BIO RAD-100擴增系統；雜交儀為韓國fine PCR公司Combi H12雜交儀，電泳為DYY-8C型電泳儀。

1.3 方法

1.3.1 毛細管血紅蛋白電泳 按照儀器操作說明書進行，標本用新鮮EDTA-K2抗凝全血無需洗滌、溶血和離心，直接裝上樣本架送入Capillarys2全自動毛細管電泳儀檢測，約30min讀取結果。

1.3.2 地貧基因檢測 新鮮枸櫞酸鈉抗凝全血，DNA提取、擴增反應、gap-PCR檢測缺失型α-地貧、RDB-PCR檢測非缺失型α-地貧及β-地貧基因分析，操作程序嚴格按照SOP進行，檢測中國人常見的 3 種缺失型 α-地貧：--SEA、-α3.7、-α4.2；3 種非缺失型 α-地貧 αCS、αQS、αWS； 以及 17 種β-地貧基因突變 CD41-42 （-TTCT）、IVSII-654（C→T）、-29（A→G）、-28（A→G）、CD71-72（+A）、CD17（A→T）、CD43（G→T）、CD26（GAG→AAG）、CD27/28（+C）、CD31（-C）、-32（C→A）、-30（T→C）、CD14-15（+G）、IVS-I-1（G→A，G→T）、IVS-I-5（G→C）、Int（ATG→AGG）、CAP（A→C）。

2 結果

2.1 異常血紅蛋白檢測 在12257例樣本中，共發現9種類型異常血紅蛋白，共計232例，異常血紅蛋白發生率1.89%，其中以Hb H、Hb CS、Hb E為主，分別為 64例、60例、52例，占比 27.59%、25.86%、22.41%。9種異常血紅蛋白分布情況見表1，檢出的各種異常血紅蛋白電泳圖譜見圖1。

2.2 Hb H病的基因分析 篩查出的64例Hb H病例中，單純Hb H 18例，Hb H合并Hb Bart’s有37例，Hb H合并Hb CS 7例，Hb H合并Hb CS及Hb Bart’s有2例。對其進行地貧基因檢測，基因型分別為--SEA/-α3.7 35例、--SEA/-α4.2 18例、--SEA/α（QS）α 2例和--SEA/α（CS）α 9例。 64例Hb H病的地貧基因確診分型情況見表2。

2.3 Hb CS的基因分析 檢測出的60例Hb CS病例中，單純CS帶51例，H帶合并CS帶7例，H帶合并CS帶及Bart’s帶有2例。對其進行地貧基因檢測，結果為--SEA/α（CS） α 9 例、α（CS） α/αα 48例、α（CS） α/α（WS） α 1例以及 αα/αα 2例。60例Hb CS的地貧基因確診分型情況見表3。

表1 232例異常血紅蛋白患者異常血紅蛋白分類及分布情況

圖1 各種異常血紅蛋白毛細管電泳圖譜

表2 64例Hb H病的地貧基因確診分型情況

表3 60例Hb CS的地貧基因確診分型情況

2.4 其他異常血紅蛋白分類及地貧基因確診情況檢出Hb E標本共52例，基因檢測結果為βCD26/βN 51例，βCD26/β-28 1例，血紅蛋白 E 病檢出率100%。檢出Hb Q標本8例，Q帶常見于Z7區，同時在Z1區可見Hb A2變異體，地貧基因檢測結果為-α4.2/αα，βN/βN， 提示異常血紅蛋白 Q 合并-α4.2缺失。另外，檢出Hb F異常增高（＞10%）及Hb K（K 帶常見于 Z11 區）、Hb J（J帶常見于 Z12區）、Hb G（G帶常見于Z6區）常規地貧基因檢測結果顯示正常，需進一步進行罕見地貧檢測，必要時進行基因測序才能檢測出結果。其他異常血紅蛋白分布情況及地貧基因檢測結果見表4。

表4 其他異常血紅蛋白分布及地貧基因檢測結果

3 討論

全自動毛細管電泳儀是近年來迅速發展起來應用于地貧篩查的工具，以其全自動、快速、高效、準確等優點得到廣泛應用[3]，其原理主要是利用充滿電泳液的石英毛細管中，以溶血劑進行稀釋的紅細胞樣品在高壓電的作用下進行分離。當樣品進入到毛細管中，無論是帶正電、負電或不帶電的粒子，都在電滲流的作用下，向陰極遷移。帶電粒子的性質、數量及體積能夠影響其在毛細管中的遷移速率，從而在電泳區域形成電泳圖譜，Sebia Capillarys 2分析軟件根據電泳速率劃分為15個區域[4]，每個區域有數據庫提示可能為何種血紅蛋白變異體。因而，能快速的對所檢測到的異常血紅蛋白進行判斷分析。

目前已發現的異常血紅蛋白有700多種，在我國發現70多種，其中大多數為珠蛋白α鏈和β鏈的變異[5]。在我國異常血紅蛋白發生率為0.337%，具有高度的分布不均一性和遺傳多態性，主要以南方地區為主，其中云南省最高，為5.93%，廣東省為0.393%。在南方地區常見的異常血紅蛋白主要為Hb E和Hb J，而北方則主要為Hb E和Hb D[6]。本研究利用毛細管血紅蛋白分析系統共篩查了12257例樣本，檢出9種異常血紅蛋白共232例，異常血紅蛋白發生率1.89%。其中Hb H 64例、Hb CS 60例、Hb E 51例；發生率分別為：0.52%、0.49%、0.42%；診斷準確度分別為100%、96.67%、100%，診斷準確度與文獻報道相近[7，8]。

Hb H病中α珠蛋白鏈的減少或缺乏使γ珠蛋白鏈和β珠蛋白鏈相對增多，多余的γ鏈聚合成 Hb Bart’s（γ4），β 鏈則聚合成 Hb H（β4），毛細管血紅蛋白電泳可檢測出不同水平的Hb H、Hb Bart’s和 Hb CS，其中 Hb H 含量約為 0.18%～40%[9]。而傳統的醋酸纖維薄膜電泳無法準確定量，且受主觀因素影響大。本次篩查出的64例Hb H病樣本基因檢測表明，Hb H病主要以缺失型為主，且以--SEA/-α3.7（又稱右缺失 RW）為主，占54.69%。非缺失型Hb H病比例較小，主要為--SEA/α（CS） α，占 14.05%。

Hb CS是α2-珠蛋白基因終止密碼子CD142（UAA＞CAA）突變，降低mRNA穩定性而引起表達水平降低，是一種不穩定性Hb，常位于Z2區帶，但不同時間解離后區帶位置不同，純合Hb CS，在電泳中定量為5%～8%，而雜合Hb CS含量很低，僅占0.5%～1%，在一般的醋酸纖維薄膜電泳中很難檢出，但在全自動電泳系統中可以檢出[10，11]。本研究中共檢測出60例Hb CS，地貧基因檢測結果有58例為αCS α攜帶者，有2例未發現異常，其原因可能與不穩定血紅蛋白降解有關。

Hb E病是東南亞最常見的異常血紅蛋白病之一，是由于β珠蛋白肽鏈第26位的密碼子GAG突變為AAG，導致Glu變成Lys，影響到mRNA前體加工的效率，從而導致β珠蛋白肽鏈合成減少，是一種β地中海貧血樣的血紅蛋白病。在毛細管電泳中，Hb E帶常見于電泳圖譜Z4區，不僅與Hb A2條帶分離，還能對其進行準確定量。本結果中的52例Hb E進行地貧基因檢測全部為βCD26攜帶者，診斷準確度100%，其中1例Hb E合并β-28，表現為中間型地貧。

Hb Q是一種慢速異常血紅蛋白，常見于Z7區，同時在Z1區可見Hb A2變異體，本結果檢出Hb Q標本8例，均檢測出-α4.2，與報道Hb Q均伴隨一個4.2缺失型α地貧的發生一致[12-15]。另外，也檢測出 Hb F異常增高（＞10%）、Hb K（K帶常見于Z11區）、Hb J（J帶常見于Z12區）及Hb G（G帶常見于Z6區），常規地貧基因檢測結果均未見異常，需進一步進行罕見地貧檢測，必要時進行基因測序才能予以確診。

綜上所述，毛細管血紅蛋白分析儀能快速、準確地篩查出各種常見異常血紅蛋白，特別在地貧高發區，應用于婚前、孕前、產前異常血紅蛋白的篩查，能避免異常血紅蛋白復合地中海貧血（如Hb E/β-地中海貧血）的中間型或重型出生缺陷的發生。對遺傳指導及產前診斷具有重要意義。本研究首次報道了清遠地區異常血紅蛋白的發生率，對今后的地貧防控具有一定指導及參考作用。

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