利用環介導恒溫擴增16S rRNA對無乳鏈球菌快速鑒定的新方法

肖偉強，潘軍，姚新偉，常彥敏，孫明月，許青霞，周麗莉

(鄭州大學附屬腫瘤醫院檢驗科，河南 鄭州 450000)

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是 B組鏈球菌 (Group B Streptococcus，GBS)唯一的一個種，是造成孕產婦生殖道感染的重要原因，嚴重時更可引起泌尿系感染、絨毛膜羊膜炎、產褥感染、新生兒感染等[1，2]。目前無乳鏈球菌的檢測方法有傳統培養、乳膠凝集實驗、免疫層析、實時熒光定量PCR和環介導恒溫恒溫擴增 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的方法等。LAMP 由日本科學家Notomi發明[3]，反應只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質等共同置于一定溫度下 （60～65℃），可在15~60min內實現109~1010倍的擴增，最后形成具有頸環結構長短不一的多個雙鏈DNA。LAMP擴增效率高，操作簡單，特異性強，底物檢測方便，廣泛用于細菌類病原微生物的現場檢測。無乳鏈球菌特異性靶基因主要有cfb基因、16S rRNA、16S-23srRNA基因的間隔區和scpB和ssrA基因等[4]。BLAST比對證明無乳鏈球菌和停乳鏈球菌16S rRNA相似度超過95%，僅在個別位點有差異，引物設計較難，因此很少有人把16S rRNA作為LAMP擴增GBS的靶基因。本文欲在此設計引物，一方面來探討以16S rRNA為靶基因來檢測GBS的可行性，另一方面來檢驗LAMP方法對序列極其相似的靶基因的區分能力。

1 材料與方法

1.1 菌株及來源 無乳鏈球菌標準菌株55191購自ATCC，其余52株無乳鏈球菌和其他131株非無乳鏈球菌（包括化膿鏈球菌12株、停乳鏈球菌停乳亞種11株、停乳鏈球菌似馬亞種23株、馬鏈球菌6株、咽峽炎鏈球菌10株、糞腸球菌20株、中間鏈球菌3株、牛鏈球菌4株、屎腸球菌26株、金黃色葡萄球菌7株、鉛黃腸球菌9株）均來自我室不同時期臨床的分離株。所有無乳鏈球菌、停乳鏈球菌停乳亞種、停乳鏈球菌似馬亞種均再次經過16S rRNA通用擴增測序后比對確證，方法見文獻[5]。

1.2 儀器與試劑 Bst DNA聚合酶、dNTPs、DNAMarker、細菌總DNA提取試劑盒均購自大連寶生物，金屬浴和凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司，引物合成由上海生工技術有限公司完成，其他試劑均購自日本Takara公司。

1.3 LAMP引物設計 選擇無乳鏈球菌16s rRNA參考基因 NR_040821.1、NR_113262.1、NR_115728.1、NR_117503.1，軟件DNAMAN7.0比對，選擇的序列為無乳鏈球菌的保守區，停乳鏈球菌的可變區。Primer Explorer(http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)在線設計共4條引物：正向外部引物F3，反向外部引物B3，和帶有互補序列的正向內部引物FIP和反向內部引物BIP，具體位置和序列詳見圖1。

圖1 LAMP引物位置及序列

1.4 LAMP擴增的反應體系 反應體系 25μl，包括：10xBst buffer 【20mMpH 為 8.8 的 Tris-HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1%Triton-100】，25mM MgCl2，2.5mM dNTPs，5M betaine，內引物(FIP 和 BIP)，外引物(F3 和 B3)，Bst DNA 聚合酶，DNA 模板，ddH2O，SYBR Green I。 結果判讀采用自然光顯色、熒光顯色和2%瓊脂糖凝膠電泳分析的方法。

1.5 LAMP擴增的條件優化 首先固定LAMP反應體系中 FIP/BIP引物的濃度為 1.6μM，F3/B3為0.4μM，模板 2μl，Bst DNA聚合酶最佳反應溫度60℃，然后逐一分別配制梯度濃度的dNTPs、betaine、鎂離子，各自采用不同的反應時間，根據反應產物瓊脂糖凝膠電泳的結果對LAMP反應體系中的以上變量進行優化。

1.6 LAMP擴增特異性檢測 用優化后的LAMP方法對52株無乳鏈球菌和131株非無乳鏈球菌進行擴增，計算假陰性和假陽性。

1.7 LAMP擴增敏感性檢測 將無乳鏈球菌55191接種于 Luria-Bertani培養基，37℃培養 18~24h[6]，取100μl菌液進行平板計數，之后，將菌液做101~106倍6個梯度的稀釋，煮沸法提取細菌基因組DNA，分別取 2μl做 LAMP和 Real Time PCR檢測，比較兩種方法的靈敏度。

2 結果

2.1 LAMP擴增條件優化 根據瓊脂糖凝膠電泳條帶的亮度，最終確定25μl反應體系中dNTPs、betaine、鎂離子分別為 0.6mM、1.0M、12mM，最佳反應時間為60min。

2.2 特異性檢測 僅52株無乳鏈球菌產生梯度條帶，其他細菌（包括34株停乳鏈球菌）均無任何條帶（圖 2）。

圖2 部分無乳鏈球菌和停乳鏈球菌LAMP擴增結果

2.3 敏感性檢測 經平板菌落計數，原始菌液濃度為3.8×105cfu/ml。將原始菌液做101~106倍6個梯度的稀釋，相同方法提取基因組DNA，分別取2μl做PCR和LAMP檢測，結果顯示，LAMP能檢出104倍的稀釋，而普通PCR僅能檢出102倍的稀釋，前者比后者的靈敏度高出近100倍（圖3）。

圖3 無乳鏈球菌敏感性檢測

3 討論

16S rRNA是細菌的系統分類研究中最有用的和最常用的分子鐘，其分子大小適中，存在于所有的生物中，在結構與功能上具有高度的保守性，素有“細菌化石”之稱，因此根據細菌16S rRNA可變區的差異可以用來區分不同的菌，目前已成為細菌種屬鑒定的標準方法[7]。但16S rRNA序列在原核生物中的高度保守性，對于相近種或同一種內的不同菌株之間的鑒別分辨力較差，特別是在某些菌屬中，16S rRNA有時差異很小，這就給LAMP引物設計帶來難度，所以目前僅有軍團菌等少數細菌的LAMP檢測試劑盒的靶基因為16S rRNA[8]，其余LAMP檢測試劑盒多在特異性功能蛋白基因上，或者變異度更大的16S-23S rRNA間隔區(Intergen ic Spacer Region，ISR)[9]。美國 Yanhong Liu[10]開發了一種環介導恒溫擴增的方法來區分停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌，他利用16s-23s的間隔區設計了三組引物，分別識別這三種細菌，證明環介導恒溫擴增的方法時間短，靈敏度高，能識別0.1pg的目標底物的模板。本文在16S rRNA處設計引物，克服了種間序列區分的難度，也成功區分了上述細菌，并且具有很高的敏感性和特異性，證明LAMP對GBS檢出的可行性；而且，與Yanhong Liu等人的方法相比，本文更加簡單方便，在16S rRNA處設計引物，可用于任何細菌，比選擇單純的功能性蛋白基因或其他特異性基因，具有更好的通用性。

LAMP擴增的特異性與其引物設計有很大關系。本課題中，引物靶基因參考了Genbank數據庫中6條無乳鏈球菌16S rRNA的參考基因，并且盡量選擇了其保守區，但相對停乳鏈球菌則位于最大變異區，所以能有效區分無乳鏈球菌和停乳鏈球菌。本文的52株無乳鏈球菌均能產生梯度條帶，其他細菌包括停乳鏈球菌均無任何條帶，說明本方法對僅有個別堿基差異的16S rRNA也能有效區分，具有很好的特異性。

LAMP擴增的敏感性方面，本文證實每ml低至40個菌落即可檢出，顯示出其超高的敏感性。McKenna JP等人利用LAMP技術擴增GBS的sip基因，證明具有100%的特異性，并能檢出最少14各拷貝的基因[11，12]；日本 Kimura[13]也曾利用環介導恒溫擴增的方法來擴增GBS的cfb基因，證明這種方法在恒溫的條件下能發現4個拷貝的模板基因，結合本文的實驗證實，LAMP方法對無乳鏈球菌的檢測具有準確、高效、靈敏等特點。但隨之而來的，LAMP擴增的高靈敏性帶來了不可避免的缺點是假陽性高，因此，盡可能所有反應均在單一閉合管中進行，避免開蓋污染。本文即在上蓋中，預加入SYBR Green I，待反應結束后上下混勻顯色，能有效避免污染。

本文的LAMP擴增優化的條件在1h內完成，有人在4條引物的基礎上設計了一對環狀引物，能大大加快反應速度，在30min內既能完成檢測，大大降低了LAMP現場檢測的要求[14，15]。對于本文環狀引物的適用，還需要進一步研究。

總之，本文設計的在16S rRNA處擴增無乳鏈球菌具有很高的靈敏度和特異性，能有效區分序列高度近似的停乳鏈球菌和無乳鏈球菌。如果利用可隨身攜帶的實時熒光檢測儀，就能在床邊完成對無乳鏈球菌快速、簡單、隨機的操作，具有很大的市場前景。

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