四引物法快速檢測白細胞介素1A基因3'UTR插入/缺失多態性

賈二娟 ，吳夢怡 ，柴麗娜 ，余樂涵 ，萬福生 ，朱偉鋒

(1、許昌市中心醫院檢驗科，河南 許昌 461000；2、南昌大學醫學部第一臨床醫學院，江西 南昌 330006；3、南昌大學醫學實驗教學部，江西 南昌330006；4、南昌大學基礎醫學院生物化學與分子生物學教研室，江西 南昌 330006)

作為IL-1家族的一個重要成員，白細胞介素1A（interleukin-1A，IL-1A）在免疫調節和炎癥反應中都發揮著十分重要的作用。位于IL-1A基因3'非翻譯區（untranslated region，UTR）的“TTCA”四堿基插入/缺失 （insertion/deletion，Ins/Del） 多態性（rs3783553） 可影響 IL-1A mRNA 和蛋白表達[1，2]，從而可能與肝癌[1]、鼻咽癌[2]、口咽癌[3]、胃癌[4]、前列腺癌[5]、卵巢上皮癌[6]、子宮內膜癌[7]、宮頸癌[8]、腦膠質瘤[9]、斑禿[10]、骨關節炎[11]等的發病相關。目前該位點的檢測方法中，有的操作較復雜，有的成本較高，所需時間較長，因此有必要建立一種快速、簡便、低成本的rs3783553檢測方法。

四引物擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應 （tetra-primer amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，T-ARMS-PCR） 是在等位基因特異性PCR基礎上建立起來的一種單核苷酸 多 態 性 （single nucleotide polymorphisms，SNPs）分型方法[12]。T-ARMS-PCR對SNPs的分型只需要四條普通引物，PCR擴增后直接進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳時條帶出現的位置即可判斷基因型，已被廣泛用于SNPs和突變的研究[13-16]。目前還沒有T-ARMS-PCR法對rs3783553檢測的報道。因此，如果針對rs3783553設計四條引物，可能會實現該多態性位點的快速、簡便、低成本檢測。

1 對象與方法

1.1 研究對象 100例血樣由在許昌市中心醫院體檢的100名志愿者（均知情同意，其中男性59名，年齡27～65歲，女性41名，年齡27～70歲）提供。每位志愿者抽取靜脈血2ml，EDTA抗凝。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 使用天根全血DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA[17]。根據超微量紫外分光光度計定量結果，取部分DNA稀釋為10ng/μl，作為PCR擴增模板。

1.2.2 PCR擴增 使用T-ARMS-PCR引物設計軟件 （http：//primer1.soton.ac.uk/primer1.html） 設 計rs3783553分型的四條引物，上游外引物：5'-GCAG ACAGTGTTTTCTGGGATAAGTAAG-3'，下游外引物：5'-TGGTCTGATCACAATTTTTAGAACCTAGA-3'，缺失型內引物：5'-CTGGGCATTCTTGTTTCAAT TTCA-3'，插入型內引物：5'-ACTTGATTGCAGGTG GAATTGACTG-3'。其中上游外引物與下游外引物配對可得到352bp的共有PCR產物，上游外引物與插入型內引物配對可得到插入型等位基因對應的236bp的PCR產物，缺失型內引物與下游外引物配對可得到缺失型等位基因對應的157bp的PCR產物。引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。 PCR 反應體系為 10μl， 包含 5μl 2×Taq master mix（上海近岸科技有限公司），10μmol/L 上下游引物各0.2μl，10μmol/L缺失型內引物和非缺失型內引物各 0.6μl，模板 1.0μl，ddH2O 2.4μl。 使用朗基MG96G PCR儀進行擴增。PCR條件：94℃預變性 3min；94℃變性 20s，58℃退火 20s，72℃延伸20s，35個循環；最后72℃延伸5min。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 PCR完成后取PCR產物4μl在2%瓊脂糖凝膠上（含溴化乙錠0.5ug/ml）電泳，150V 30min后凝膠成像系統拍照。

1.2.4 DNA測序 隨機選取10例在瓊脂糖凝膠電泳表現為不同帶型的樣本擴增后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。PCR反應體系為20μl，包含 10μl 2×Taq master mix，10μmol/L 上下游引物各 0.4μl，模板 1.0μl，ddH2O 8.2μl。PCR 條件：94℃預變性 3min；94℃變性 20s，58℃退火 20s，72℃延伸20s，35個循環；最后72℃延伸5min。

2 結果

2.1瓊脂糖凝膠電泳結果 圖1為6例樣本rs3783553的T-ARMS-PCR分型電泳圖。從圖中可知，rs3783553的T-ARMS-PCR產物有3種情況：出現236bp和352bp的Ins/Ins基因型，出現157bp和352bp的Del/Del基因型，出現157bp、236bp和352bp的Ins/Del基因型。100例樣本中Del/Del基因型39例，Ins/Ins基因型10例，Ins/Del基因型51例。

圖1 rs3783553的T-ARMS-PCR分型電泳圖

2.2 DNA測序結果 DNA測序結果（圖2）顯示在瓊脂糖凝膠電泳表現為236bp和352bp的都是rs3783553的Ins/Ins基因型（圖2-A），在瓊脂糖凝膠電泳表現為157bp和352bp的都是rs3783553的Del/Del基因型（圖2-B），在瓊脂糖凝膠電泳表現為 157bp、236bp和 352bp的都是 rs3783553的Ins/Del基因型 （圖2-C），與T-ARMS-PCR法對rs3783553的分型結果完全一致。

圖2 rs3783553不同基因型樣品測序圖

3 討論

研究表明，IL-1A基因是miR-122的靶基因之一。IL-1A基因3'UTR區DNA序列可顯著影響miR-122與其的結合。rs3783553的Ins等位基因破壞了miR-122與IL-1A的結合，從而增加了IL-1A的轉錄活性，發揮抗腫瘤效應[1]。Meta分析也認為該多態性與我國漢族人口癌癥易感性相關，其中Ins等位基因可能是中國漢族人群的保護因素，而Del等位基因則可能是癌癥易感因素[18]。也有研究認為該多態性還與腫瘤的復發相關[19]。

就rs3783553的檢測方法來說，目前主要有聚合酶鏈反應-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polymerase chain reaction-polyacrylamide gel electrphoresis，PCR-PAGE）法[1-10]、DNA 直接測序法[11]、TaqMan 探針法[20]等。PCR-PAGE是目前rs3783553檢測最常用的方法，其最大的優點是一次可對較多樣本進行檢測，成本較低。但該方法需要配制聚丙烯酰胺凝膠，電泳結束后還需要染色、漂洗、顯色等步驟，操作較復雜。DNA直接測序法是檢測DNA序列的金標準，但需要昂貴的設備，成本較高。TaqMan探針法能夠簡便的對rs3783553進行檢測，但引物需要修飾，因此成本較高。此外也需要用到昂貴的設備。

從圖 1可知，Ins/Del基因型的 157bp、236bp的特異性片段的亮度相當，表明PCR的體系合適。Ins/Ins基因型的352bp共有片段很弱，可能是因為插入型內引物與上游外引物的結合影響了上游外引物和下游外引物的結合。Ins/Del基因型的352bp片段較Del/Del基因型的352bp稍弱也說明了這一點。本研究中三種基因型的分布與北京[1]、江蘇[1]、大連[11]等正常人群中基因型的分布接近和DNA測序與T-ARMS-PCR法的分型結果完全一致都證明了本方法的可靠性。Delvaux等用T-ARMSPCR、PCR-RFLP、TaqMan探針和DNA直接測序的方法對IL-28B基因上的兩個SNPs進行了分析，結果表明T-ARMS-PCR方法的成本效益比最好，而且快速、簡便，不需要特殊的設備，適合在發展中國家使用[15]。

總的來說，本研究建立的四引物檢測IL-1A基因3'UTR插入/缺失多態性的方法，是一種能在普通實驗室開展的操作簡便、快速、低成本的檢測方法。

[1]Gao Y，He Y，Ding J，et al.An insertion/deletion polymorphism at miRNA-122-binding site in the interleukin-1alpha 3'untranslated region confers risk for hepatocellular carcinoma[J].Carcinogenesis，2009，30(12)：2064-2069.

[2]Yang ZH，Dai Q，Zhong L，et al.Association of IL-1 polymorphisms and IL-1 serum levels with susceptibility to nasopharyngeal carcinoma[J].Mol Carcinog，2011，50(3)：208-214.

[3]Zhang Y，Sturgis EM，Sun Y，et al.A functional variant at miRNA-122 binding site in IL-1A 3'UTR predicts risk and HPV-positive tumours of oropharyngeal cancer[J].Eur J Cancer，2015，51(11)：1415-1423.

[4]Zhang J，Shi H，Xue M，et al.An insertion/deletion polymorphism in the interleukin-1A 3'untranslated region confers risk for gastric cancer[J].Cancer Biomark，2016，16(3)：359-365.

[5]廖洪，張林，陳鵬，等.白細胞介素1A基因3'-UTR插入/缺失多態與中國漢族前列腺癌的相關性研究 [J].四川大學學報醫學版，2014，45(6)：956-959.

[6]Zhang Z，Zhou B，Gao Q，et al.A polymorphism at miRNA-122-binding site in the IL-1α 3'UTR is associated with risk of epithelial ovarian cancer[J].Fam Cancer，2014，13(4)：595-601.

[7]Yu X，Zhou B，Zhang Z，et al.Insertion/deletion polymorphism in IL1A 3'-UTR is associated with susceptibility to endometrial cancer in Chinese Han women[J].J Obstet Gynaecol Res，2016，42(8)：983-989.

[8]Pu Y，Zhang Z，Zhou B，et al.Association of an insertion/deletion polymorphism in IL1A 3'-UTR with risk for cervical carcinoma in Chinese Han Women[J].Hum Immunol，2014，75(8)：740-744.

[9]司馬秀田，劉浩，楊燕武，等.miR-122靶基因IL-1A3'UTR插入/缺失多態性與腦膠質瘤關聯分析 [J].中華腫瘤防治雜志，2013，20(8)：580-582.

[10]Lu D，Chen L，Shi X，et al.A functional polymorphism in interleukin-1α(IL1A)gene is associated with risk of alopecia areata in Chinese populations[J].Gene，2013，521(2)：282-286.

[11]Yang F，Hu A，Zhao D，et al.An insertion/deletion polymorphism at the microRNA-122 binding site in the interleukin-1α 3'-untranslated region is associated with a risk for osteoarthritis[J].Mol Med Rep，2015，12(4)：6199-6206.

[12]Ye S，Dhillon S，Ke X，et al.An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphism[J].Nucleic Acids Res，2001，29(17)：E88-8.

[13]Islam M，Awan FR，Baig SM.Development of ARMS-PCR assay for genotyping of Pro12Ala SNP of PPARG gene：a cost effective way for case-control studies of type 2 diabetes in developing countries[J].Mol Biol Rep，2014，41(9)：5585-5591.

[14]Honardoost MA，Tabatabaeian H，Akbari M，et al.Investigation of sensitivity，specificity and accuracy of Tetra primer ARMS PCR method in comparison with conventional ARMS PCR，based on sequencing technique outcomes in IVS-II-I genotyping of beta thalassemia patients[J].Gene，2014，549(1)：1-6.

[15]Delvaux N，da Costa VD，da Costa MM，et al.Comparison of four methods of genotyping IL28B polymorphisms in chronic hepatitis C patients[J].J Virol Methods，2015，220：1-4.

[16]Zhang S，Dang Y，Zhang Q，et al.Tetra-primer amplification refractory mutation system PCR(T-ARMS-PCR)rapidly identified a critical missense mutation (P236T)of bovine ACADVL gene affecting growth traits[J].Gene，2015，559(2)：184-188.

[17]李麗華，徐顏美，李靜，等.江西漢族人群NRG3基因rs17101655 T→G單核苷酸多態性與ITP的關聯性研究[J].實驗與檢驗醫學，2014，32(3)：237-239.

[18]劉芳騰，曲強冠，朱正明，等.白細胞介素1A基因3'-UTR I/D多態性與中國漢族人群癌癥易感性的Meta分析[J].中國老年學雜志，2017，37(6)：1393-1396.

[19]Wang C，Sturgis EM，Chen X，et al.A functional variant at miRNA-122 binding site in IL-1a 3'UTR predicts risk of recurrence in patients with oropharyngeal cancer[J].Oncotarget，2016，7(23)：34472-34479.

[20]陳雪琴，王英，婁嬌，等.MicroRNA-122結合區遺傳變異IL-1A rs3783553與慢性HBV感染的關聯研究 [J].華中科技大學學報(醫學版)，2016，45(1)：53-55.