敗醬草抑制大腸癌HCT-8／5-FU細胞耐藥的作用研究

周 莊 ，劉望予 ，婁云云 ，湯錦周 ，王建榮 ，陳錦緞

（1.福州市第二醫院，福建 福州 350007；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

大腸癌發病率和死亡率均呈逐年上升趨勢，每年新增病例高達120萬，死亡病例也遠超60萬人［1－2］。 化療是大腸癌晚期患者、轉移性患者等不適合手術患者的主要治療方式［3］，5-氟尿嘧啶（5-FU）是大腸癌化療的基礎用藥［4］，廣泛應用于大腸癌治療。然而，耐藥的產生和毒副作用的存在是影響其臨床療效并最終導致治療失敗的主要原因［5］。因此，抑制耐藥性將有助于提高化療藥物療效和降低化療藥物使用濃度，從而降低化療導致的毒副作用。

大腸癌屬中醫“腸癖”“腸覃”范疇，以“濕熱蘊毒下迫大腸、熱傷腸絡、毒邪成癰”為主要病機，“清熱解毒、消癰散結”是其治法治則之一［6－7］。 敗醬草屬敗醬科植物黃花敗醬、白花敗醬的干燥全草，具有清熱解毒、祛瘀止痛、消癰排膿的功效，符合大腸癌“清熱解毒、消癰散結”治法治則［8－9］，已有研究報道，敗醬草在臨床中廣泛應用于大腸癌等惡性腫瘤的治療，且療效確切［10］。基礎研究也證實了敗醬草具有顯著抑制大腸癌細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制血管新生以及抑制炎癥相關因子的作用［11-15］。然而，對大腸癌治療藥物5-FU耐藥的影響尚未見報道，因此，本課題探討了敗醬草對5-FU耐藥性的影響。

1 材料

1.1 細胞株和藥物 人源性腸癌細胞株HCT-8和耐5-FU的HCT-8／5-FU細胞株均購于江蘇南京凱基生物科技發展有限公司；敗醬草全草購于福建中醫藥大學國醫堂。

1.2 試劑 胎牛血清（FBS）、RPMI 1640空白培養基、含 EDTA（0.25%）的胰蛋白酶（美國 GBICO公司）；PBS、青霉素-鏈霉素（美國 Hyclone公司）；結晶紫、MTT（美國 Amresco公司）；5-FU粉末、阿霉素（美國Sigma公司）。

1.3 儀器 細胞培養工作臺（蘇州凈化設備公司）；CO2培養箱（美國Thermo Fisher公司）；離心機（德國Eppendorf公司）；全自動酶標儀（美國Bio－Tek公司）；熒光倒置顯微鏡系統（德國徠卡公司）。

2 方 法

2.1 藥物配制 敗醬草全草500 g溶入4 000 mL 80%乙醇中，加熱回流提取2次，每次30 min，提取液過濾，濾液減壓濃縮（50℃，0.01MPa）至相對密度1.05，噴霧干燥（進出口溫度為 140℃／80℃）得干粉［16］；稱量適量提取物，用 50%DMSO 和 50%PBS溶解，配制成 250 mg／mL的儲存溶液，經震蕩和超聲后，-20℃分裝保存備用；使用前置室溫恢復，用RPMI 1640完全培養基稀釋成所需的濃度并過濾，并用 DMSO 補齊［16］。

2.2 5-FU溶液配制 采用DMSO溶解適量的5-FU粉末，并配制成1M的存儲液，置于-20℃冰箱保存備用。使用時采用倍比稀釋法將5-FU儲存液用完全培養基配制成所需的使用濃度，用于細胞干預。

2.3 細胞培養 將細胞置于25 cm2的培養瓶中培養，待細胞覆蓋率達80%～90%時，用含EDTA的胰酶消化（每瓶加入0.8 mL胰酶，消化2～3 min）；待細胞消化下來后，加入2～3倍體積的新鮮完全培養基（完全培養基含10%FBS、100 U／mL青霉素和100 μg／mL 鏈霉素的 RPMI 1640 培養液）中和，將上述細胞懸液轉移到15 mL的離心管中離心（1 000 轉 ／min，3～5 min）；離心結束后，棄上清，并加入5 mL新鮮培養基，重懸、計數，用于后續的接種、傳代。HCT-8細胞用RPMI 1640完全培養基培養，HCT-8／5-FU 用含 15 μg／mL RPMI 1640 完全培養基培養，實驗前改用不含5-FU的RPMI 1640完全培養基培養。

2.4 倒置顯微鏡觀察細胞生長 HCT-8和HCT-8／5-FU 分別按 2×105／mL接種于 6孔板中（2 mL／孔），置于培養箱中培養過夜，并給予不同濃度的5-FU 干預（0～200 μM）或敗醬草干預（0～2 mg／mL）。藥物干預24 h后通過倒置顯微鏡（×200）觀察細胞生長。

2.5 MTT法檢測細胞活力 取對數生長期的HCT-8／5-FU細胞及其親本細胞HCT-8，分別接種于96孔板（100 μL ／孔，0.8×105／mL）；細胞置于培養箱中培養過夜后，分別加入終濃度為 0、50、100和200 μM 5-FU 溶液 （HCT-8／5-FU 細胞和 HCT-8細胞）或 0、0.5、1、2 mg／mL 敗醬草溶液（HCT-8／5-FU細胞）干預24 h，每個劑量各3各復孔。實驗結束后，棄上清液，每孔加入 MTT 溶液（100 μL／孔，0.5 mg／mL）并在培養箱中避光孵育4 h；孵育結束后，棄 MTT 溶液，并加入 DMSO（100 μL／孔）溶解，采用全自動酶標儀（波長為570 nm）測定OD值，并根據OD值計算細胞的活力。以對照組細胞活力為100%，實驗組的細胞活力＝實驗組OD值／對照組OD值×100%。

2.6 熒光倒置顯微鏡觀察阿霉素（ADM）蓄積情況取對數生長期HCT-8／5-FU細胞接種于6孔板（1×105／mL，2 mL／孔），細胞置于培養箱中培養過夜后，分別給予不同濃度的敗醬草溶液（0～2 mg／mL）干預24 h。實驗結束后，棄上清，PBS清洗3遍，加入適量的阿霉素染色溶液（5 μM，1 mL／孔），培養箱避光孵育后，用預冷的PBS清洗3遍，用熒光倒置顯微鏡觀察拍照（×200）。

2.7 統計學方法 數據采用SPSS 20.0統計軟件分析。計量資料屬正態分布的以（x±s）表示，2組數據和多組數據分別采用獨立樣本t檢驗和多因素方差分析。

3 結 果

3.1 HCT-8／5-FU細胞株對5-FU具有耐藥性驗證 HCT-8和HCT-8／5-FU細胞分別經不同濃度5-FU（0、50、100、200 μmol／L）干預后，倒置顯微鏡觀察發現HCT-8細胞數目逐漸減少，部分細胞出現皺縮、變圓和漂浮等現象，而HCT-8／5-FU細胞未見明顯細胞形態和細胞數量改變，可見其具有一定的耐藥性（圖1A）。這一現象進一步通過MTT實驗進行驗證，MTT檢測結果如圖1B所示：HCT-8細胞經不同濃度5-FU干預后，細胞活力顯著降低；而HCT-8／5-FU細胞在不同濃度5-FU干預后，細胞活力下降不明顯；在相同濃度5-FU干預下，HCT-8的細胞活力顯著低于HCT-8／5-FU細胞。進一步證實了HCT-8／5-FU細胞對5-FU具有一定的耐藥性。

圖1 HCT-8／5-FU細胞耐藥性驗證圖（×200）

3.2 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞生長的影響 倒置顯微鏡的觀察結果如圖2所示：不同濃度敗醬草（0.5～2 mg／mL）干預后，HCT-8／5-FU 細胞覆蓋率明顯降低，可見部分細胞變小、變圓，提示敗醬草對HCT-8／5-FU細胞的生長有一定的抑制作用。

3.3 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞活力的影響 如圖3所示：用不同濃度的敗醬草溶液干預24 h，HCT-8／5-FU細胞株細胞活力明顯降低，具有統計學差異（P＜0.05）；且濃度越高，細胞活力越低。實驗結果進一步證實了敗醬草對HCT-8／5-FU細胞生長的抑制作用。

圖2 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞形態的影響（×200）

3.4 敗醬草溶液對HCT-8／5-FU細胞阿霉素蓄積的影響 阿霉素具有自帶熒光的特性，阿霉素在細胞內的熒光強度可以反映其在細胞內的濃度從而反映細胞膜的外排功能。本研究采用阿霉素染色和倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度敗醬草干預對阿霉素蓄積的影響。如圖4所示：與對照組比較（熒光較弱），不同濃度敗醬草溶液（0.5～2 mg／mL）干預后，可顯著增加阿霉素（紅色熒光）在HCT-8／5-FU細胞株細胞內的蓄積。結果提示敗醬草具有抑制HCT-8／5-FU細胞膜藥物外排的作用。

圖3 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞活力的影響

圖4 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞阿霉素蓄積的影響（×200）

4 討論

5-FU是大腸癌化療基礎用藥，在體內會轉化成氟尿嘧啶核苷酸，具有抑制DNA、RNA合成的作用［17］，臨床上廣泛應用于消化系統腫瘤的治療［4］。然而化療過程產生耐藥是影響化療療效和最終導致治療失敗的最主要原因。腫瘤化療導致的耐藥機制極其復雜，其中ABC家族蛋白高表達介導的細胞膜的外排功能異常增強和細胞凋亡增殖蛋白異常表達介導的凋亡抵抗是腫瘤細胞產生耐藥功能的主要機制之一［18］，因此，抑制腫瘤細胞生長和藥物外排功能是抑制耐藥的重要途徑之一。

中藥治療惡性腫瘤的歷史悠久，療效可佳，而且相對化療藥物，具有毒副作用較小和作用靶點多等特點。基礎研究已證實敗醬草具有顯著抑制大腸癌細胞增殖、誘導細胞凋亡和抑制血管新生的作用［10-12］。本研究進一步研究了敗醬草具有顯著抑制HCT-8／5-FU細胞的作用，同時也初步證實了敗醬草干預能夠抑制HCT-8／5-FU細胞的外排功能。可見，敗醬草對大腸癌耐藥具有一定的抑制作用。

大腸癌耐藥的發生發展過程極為復雜，其發生機制與多條信號轉導通路的異常調控密切相關，而敗醬草治療大腸癌具有多成分、多靶點的作用特點。本研究僅從細胞層面觀察敗醬草對于大腸癌耐藥的影響，敗醬草對于大腸癌耐藥細胞的調控作用及復雜機制的研究仍有待進一步深入。

參考文獻：

［1］ JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al.Global cancer statistics ［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［2］ BRENNER H，KLOOR M，POX C P.Colorectal cancer ［J］.Lancet，2014，383（9927）：1490-1502.

［3］ 徐珊，徐昌芬.腫瘤多藥耐藥性發生機制及中藥逆轉作用的研究進展［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2006，13（6）：404-411.

［4］ CARRILLO E，NAVARRO S A，RAMIREZ A，et al.5-Fluorouracil derivatives：a patent review ［J］.International Society of Amyloidosis，2015，25（10）：1-14.

［5］ OHTSU A.Chemotherapy for metastatic gastric cancer：past，present，and future ［J］.Gastroenterol，2008，43（4）：256-264.

［6］ 陳葉，劉金濤，朱源，等.大腸癌中醫辨證及治療概況［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2015，11（3）：243-251.

［7］ 楊靜，劉洪斌，李東華.清熱解毒方改善膿毒癥大鼠臟器功能的比較［J］.中國中西醫結合外科雜志，2012，18（2）：157-160.

［8］ 趙棟，丁青，肖藝.敗醬草的研究進展［J］.中醫藥導報，2009，15（10）：76-78.

［9］ 王蒨.敗醬草的研究進展［J］.醫學綜述，2009，15（13）：2021-2022.

［10］高學敏.中藥學［M］.7版.北京：中國中醫藥出版社，2002：140-142.

［11］ CHEN L，LIU L，YE L，et al.Patrinia scabiosaefolia inhibits colorectal cancer growth through suppression of tumor angiogenesis ［J］.Oncol Rep，2013，30（3）：1439-1443.

［12］ LIU L，SHEN A，CHEN Y，et al.Patrinia scabiosaefolia induces mitochondrial-dependent apoptosis in a mouse model of colorectal cancer ［J］.Oncol Rep，2013，30（2）：897-903.

［13］ PENG J，CHEN Y，LIN J，et al.Patrinia scabiosaefolia extract suppresses proliferation and promotes apoptosis by inhibiting the STAT3 pathway in human multiple myeloma cells ［J］.Mol Med Rep，2011，4（2）：313-318.

［14］ ZHANG M，SUN G，SHEN A，et al.Patrinia scabiosaefolia inhibits the proliferation of colorectal cancer in vitro and in vivo via G1 ／S cell cycle arrest ［J］.Oncol Rep，2015，32（2）：856-860.

［15］ LEE E J，KIM C，KIM J Y，et al.Inhibition of LPS-induced inflammatory biomarkers by ethyl acetate fraction of Patrinia scabiosaefolia through suppression of NF-κB activation in RAW 264.7 cells ［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2012，34（2）：282-291.

［16］黃煒，楊斌，陳陽，等.敗醬草乙醇提取物對人結腸癌細胞Caco-2 凋亡與增殖的影響［J］.福建中醫藥，2013，44（3）：57-59.

［17］ TOLBA M F，ABDEL-RAHMAN S Z.Pterostilbine，an active component of blueberries，sensitizes colon cancer cells to 5-fluorouracil cytotoxicity ［J］.Sci Rep，2015，16（5）：15239.

［18］ BROXTERMAN H J，GOTINK K J，VERHEUL H M.Understanding the causes of multidrug resistance in cancer：a comparison of doxorubicin and sunitinib ［J］.Drug Resist Updat，2009，12（5）：114-126.