加味陽和湯對硬皮病小鼠皮膚β-Catenin表達的影響

施 紅，林丹丹，周 勇

（福建中醫藥大學，福建 福州 350122）

硬化?。╯ystemic sclerosis，SSc）是以損害皮膚甚或多個器官、系統的炎性纖維化、小血管病變為主要特點的慢性、進行性自身免疫性疾病［1］，其發病機制尚不明確。近年研究發現：β-catenin作為促纖維化通路——Wnt／β-Catenin信號通路中重要的樞紐因子，在SSc的發病過程中可能發揮著潛在的重要作用［2-5］。我們認為SSc可歸屬中醫“痹癥”范疇，其病機之根本在于邪氣痹阻經脈。氣血不足，脾腎陽虛，溫煦不能是其發病的內在基礎；外感風、寒、濕等邪氣，內生濕、痰、瘀是其條件；且與情志刺激，飲食不節等密切相關。加味陽和湯是由《外科證治全生集》中陽和湯化裁而來，其治療硬皮病的臨床療效確切［6］。本實驗通過加味陽和湯治療硬皮病小鼠模型，觀察小鼠皮膚中β-catenin治療前后表達水平變化，來探討其可能的機理。

1 材料與方法

1.1 動物 40只健康BALB／C小鼠，SPF級，雌性，6周齡，體質量（20±2）g，購于上海市西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2012-0002，飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF級實驗室中，標準飼料、單籠4只飼養小鼠，明暗周期為12 h，自由取食和飲水。

1.2 藥物 采用加味陽和湯（《外科證治全生集》），組成：熟地黃 30 g，鹿角膠 6 g，干姜 6 g，桂枝 6 g，麻黃 9 g，白芥子 9 g，金銀花 15 g，玄參 15 g，當歸7 g，龜甲6 g，甘草3 g。水煎煮后過濾，濃縮至流浸膏，乙醇醇提，濾過，回收乙醇，最終濾液加水調至含生藥量1.12 g／mL，分裝滅菌，購自福建省第三人民醫院。注射用鹽酸博來霉素（BLM，日本化藥株式會社）溶于高壓滅菌的生理鹽水中，配制成最終濃度為500 μg／mL。醋酸地塞米松片（福州市海王福藥制藥公司）溶于生理鹽水將其配制成濃度為0.2 mg／mL醋酸地塞米松混懸液。

1.3 主要試劑及儀器 β-actin抗體（美國Sigma公司，批號：SAB1305567）；β-catenin 抗體（美國 CST公司，批號：#9562）；P-β-catenin 抗體（美國 CST 公司，批號：#9561）；Trizol總 RNA 提取液、逆轉錄試劑盒、qPCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；兔抗小鼠多克隆抗體、二抗HRP標記山羊抗兔IgG（美國CST公司）。

1.4 模型制備及給藥 40只雌性BALB／c小鼠背部中央區被毛剃除，隨機分為正常組、空白組各8只，造模組24只。第1～4周，空白組予背部皮下注射生理鹽水0.1 mL，造模組予背部皮下注射濃度為500 μg／mL 的博萊霉素 0.1 mL／d 制備硬皮病模型，正常組不注射，連續4周。造模成功后造模組隨機分為模型組、陽和湯組、地塞米松組各8只。第5～8周行藥物干預治療，各組用藥劑量均按臨床等效量灌胃，即小鼠（體質量20 g）使用醋酸地塞米松片劑量為0.04 mg／d，加味陽和湯劑量為22.4 mg／d。灌胃前用蒸餾水將備用藥物稀釋成相應濃度。陽和湯組予加味陽和湯、地塞米松組予地塞米松灌胃處理，正常組、空白組和模型組予等容量生理鹽水灌胃，0.2 mL／20 g，1 次 ／d。

2 指標檢測

2.1 皮膚組織HE染色 ①將已包埋的組織蠟塊用切片機切成4 μm的薄片，貼附在防脫載玻片上，60℃恒溫箱中烘干1 h；② 二甲苯脫蠟2道，每道各5 min；③ 依次用 100%-100%-95%-90%-80%-70%乙醇脫蠟至水，時間分別為3-3-2-2-2-2 min，蒸餾水沖洗、浸泡；④ 蘇木素浸染 7 min，流水沖洗；⑤ 1%鹽酸乙醇分色6 s，流水下稍沖洗；⑥ 伊紅染液復染約5 min，流水沖洗；⑦ 依次用70%-80%-90%-95%-100%-100%乙醇脫水，時間分別為15 s-15 s-15s-30 s-2 min-2 min；⑧ 二甲苯透明2道，每道3 min；⑨ 放在專用通風櫥吹干后，給予中性樹膠進行封片，而后在顯微鏡下拍照。

2.2 實時熒光定量PCR檢測（quantitative real-time PCR，qPCR） 取皮膚組織100 mg，用液氮研碎后加入1 mL Trizol總RNA提取液，提取小鼠皮膚組織總RNA，蛋白核酸分析儀測定RNA濃度，甲醇變性電泳鑒定RNA完整性。參照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA。熒光定量PCR擴增目的基因，引物序列如下：

表1 引物序列表

圖1 各組小鼠皮膚組織HE染色圖（×400）

PCR擴增目的基因參照qPCR試劑盒，采用兩步法PCR擴增標準程序：① 預變性，95℃ 10 s；②PCR反應40個循環，95℃ 5 s，60℃ 30 s；③ 解離。根據反應結果讀取數值，計算2^-△△CT值，分析統計結果。

2.3 蛋白質印跡法（Western blot）檢測 皮膚組織剪碎后置于勻漿器中，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑 PMSF（100∶1），4℃裂解 30 min，高速離心后取上清液，按照BCA試劑盒說明書測蛋白濃度，再加入適量蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min變性蛋白，分裝后-80℃保存。10%SDS-PAGE凝膠電泳后轉印蛋白到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗兔多克隆β-Catenin（1∶1000） 4℃孵育過夜，37℃搖床下孵育二抗 2 h。 β-actin（1∶3000）作為內參。

2.4 統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行分析。計量資料屬正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 皮膚組織HE染色結果 治療后與正常組比較：空白組無明顯差異；模型組可見真皮層增厚，排列紊亂，皮下脂肪層變??；陽和湯組真皮層稍變薄，膠原纖維束排列較疏松，皮下脂肪層稍變薄；地塞米松組真皮層膠原纖維增生情況改善，毛囊萎縮情況有所好轉。見圖1。

3.2 各組小鼠皮膚組織β-Catenin mRNA表達水平 見表2。

3.3 各組小鼠皮膚組織β-Catenin蛋白表達水平見圖 2、表 3。

4 討論

中醫沒有確切的病名與硬皮病對應，課題組認為硬皮病可歸屬中醫“痹癥”范疇，其病機之根本在于邪氣痹阻經脈。課題組在臨床上審證求因，在結合硬皮病患者個體情況辨證分析的同時，把握病變機理，認為患者正氣不足，脾腎陽虛，或內有沉寒痼冷，或衛外不固，風寒濕之邪，留滯不去，傳舍于經絡，外凝于肌表腠理，使全身皮膚頑硬（體表微循環障礙），內舍于臟腑（臟腑微循環障礙），甚至危及生命。筆者根據多年臨床經驗，總結本病多數患者伴有畏寒肢涼，肢端青紫蒼白、僵硬、腫脹，大便溏薄稀，舌淡嫩，苔白，脈沉細或弦澀，一派陽虛血瘀硬化性皮損以及臟腑纖維化征象，臨床上在加味陽和湯基礎上，予辛藥、藤藥、蟲藥直接通絡，通補兼施，持久緩圖，修復既有病理損傷。

表2 各組小鼠皮膚組織β-Catenin mRNA表達水平（x±s）

圖2 各組小鼠皮膚組織β-Catenin蛋白表達

表3 各組小鼠皮膚組織β-Catenin、P-β-Catenin 的蛋白表達量（x±s）

有研究發現Wnt／β-Catenin信號能誘導SSc纖維化［7］。TGF-β信號是纖維化的核心通路，是病理性成纖維細胞激活和膠原過度釋放的主要驅動者［8］。TGF-β信號和 Wnt／β-Catenin信號之間存在交互作用，在SSc病變組織中，TGF-β信號還能夠促進在纖維化過程中具有重要作用的p300的表達［9］，進而調控β-Catenin的表達。β-Catenin活化后可使成纖維細胞轉分化為肌成纖維細胞，過度合成細胞外基質，引起SSc皮膚纖維化。

本研究結果顯示：皮下注射生理鹽水小鼠皮膚β-Catenin mRNA及蛋白表達量與未注射正常組無差異，可見皮下注射非藥物對wnt／β-Catenin通路指標沒有影響。qPCR及WB結果顯示：模型組皮膚β-Catenin的mRNA和蛋白表達水平較正常組增強，可見BLM可以誘導硬皮病小鼠皮膚發生纖維化；經加味陽和湯干預后，硬皮病小鼠皮膚β-Catenin的mRNA及蛋白表達水平均明顯降低，表明加味陽和湯對抗硬皮病皮膚纖維化確有療效，其發揮治療作用可能是通過抑制皮膚β-Catenin的活化，來減輕硬皮病模型小鼠的皮膚纖維化程度。

參考文獻：

［1］ REBECCA M，FRANCESCO B.Immunotherapy of systemic sclerosis ［J］.Immunotherapy，2010，2（6）：863-878.

［2］ WEI J，FANG F，LAM A P，et al.Wnt／β-catenin signaling is hyperactivated in systemic sclerosis and induces Smad-dependent fibrotic responses in mesenchymal cells ［J］.Arthritis&Rheumatology，2012，64（8）：2734-2745.

［3］ VERENA A，NISHA B，JOCHEN W，et al.WNT／β-catenin signaling induces IL-1β expression by alveolar epithelial cells in pulmonary fibrosis ［J］.American Journal of Respiratory Cell&Molecular Biology，2013，49（1）：96-104.

［4］ CHRISTMANN R B，PERCIVAL S B，GIUSEPPINA S，et al.Association of Interferon-and transforming growth factor β-regulated genes and macrophage activation with systemic sclerosisrelated progressive lung fibrosis ［J］.Arthritis&Rheumatology，2014，66（3）：714-725.

［5］ BEYER C，SCHRAMM A，AKHMETSHINA A，et al.β-catenin is a central mediator of pro-fibrotic Wnt signaling in systemic sclerosis ［J］.Annals of the Rheumatic Diseases，2012，71（5）：761-767.

［6］ 林丹丹，施紅.施紅教授應用陽和湯治療系統性硬化病經驗［J］.福建中醫藥，2016，47（2）：45-46.

［7］ 鄧岱，劉文虎.Wnt／β-catenin信號通路在慢性腎臟病血管鈣化中作用的研究進展［J］. 醫學研究雜志，2016，45（1）：170-173.

［8］ CHRISTMANN R B，PERCIVAL S B，GIUSEPPINA S，et al.Association of Interferon-and transforming growth factor β-regulated genes and macrophage activation with systemic sclerosisrelated progressive lung fibrosis ［J］.Arthritis&Rheumatology，2014，66（3）：714-725.

［9］ GHOSH A K，SWATI B，ROBERT L，et al.p300 is elevated in systemic sclerosis and its expression is positively regulated by TGF-β：epigenetic feed-forward amplification of fibrosis ［J］.Journal of Investigative Dermatology，2013，133（5）：1302-1310.