肝病實(shí)脾法對(duì)急性肝損傷小鼠肝抗氧化能力的影響

王 洋，林振昆，曾友強(qiáng)，李秀娟，殷娉宇，郭明章

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

實(shí)脾法是中醫(yī)藥治療肝病的一個(gè)重要治法，早在《難經(jīng)》《金匱要略》中就提出了“見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”的觀點(diǎn)，該治法體現(xiàn)了中醫(yī)治病的整體觀和治未病的思想，其強(qiáng)調(diào)“實(shí)脾”的觀點(diǎn)對(duì)現(xiàn)代臨床治療肝病具有重要的指導(dǎo)意義，但該治法對(duì)肝損傷防治作用的影響機(jī)制尚在探討。益氣健脾法是中醫(yī)治療肝病中常用的“實(shí)脾”法之一［1-5］。本研究用健脾益氣方四君子湯與治療肝病的常用經(jīng)方四逆散，分別單方使用、兩方合用做為造模前的治療性干預(yù)用藥，擬采用尾靜脈注射刀豆蛋白（ConA）法建立小鼠急性肝損傷模型，探討肝病實(shí)脾法對(duì)急性肝損傷小鼠肝抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6～8周齡健康BALB／C雄性小鼠50只，體重（20±2）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCK（滬）2012-0002。

1.1.2 藥物及制備 四君子湯、四逆散、四君子湯與四逆散合方均按《方劑學(xué)》［6］規(guī)定的劑量比例稱(chēng)取。四君子湯組成：黨參10 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，炙甘草5 g；四逆散組成：柴胡10 g，赤芍10 g，枳殼10 g，炙甘草5 g。四君子湯與四逆散組即以上兩方劑量合用。以上均按傳統(tǒng)方法水煎，煎煮2次，取2次水煎液合并后濃縮成含生藥量約1 g／mL，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 試劑與儀器 ConA（德國(guó)Sigma公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Infinite M200多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；3K15低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；AE100電子天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）。

1.2 模型制備及給藥方法 50只BALB／C雄性小鼠隨機(jī)分成5個(gè)組，每組10只，分別為對(duì)照組、模型組、四君子湯組、四逆散組、四君子湯合四逆散組。在造模前對(duì)各組給予灌胃給藥，給藥劑量為0.02 mL／g鼠重。其中對(duì)照組、模型組給予蒸餾水灌胃，四君子組給予四君子湯濃縮液，四逆散組給予四逆散湯濃縮液，四君子湯合四逆散組給予四君子湯合四逆散湯濃縮液，每天1次，連續(xù)給藥4 d。在最后1次給藥后4 h造模，行靜脈注射2 mg／mL ConA 0.2 mL／只，ConA溶解于1×PBS里，以誘導(dǎo)肝損傷，其中正常組小鼠均給予尾靜脈注射PBS 2 mL／只［7－8］。各組小鼠于造模后6 h行目?jī)?nèi)眥靜脈叢取血，頸椎脫臼處死，解剖動(dòng)物取部分肝組織剪碎，置于液氮中固定后，于-80℃保存。

1.3 血清AST、ALT、NO測(cè)定 實(shí)驗(yàn)中通過(guò)目?jī)?nèi)眥靜脈叢取血，全血離心，取上清液，按照AST、ALT、NO試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4 肝組織勻漿MDA、SOD、GSH測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取于-80℃保存的小鼠肝臟，加入9倍預(yù)冷的生理鹽水，勻漿，離心后取上清液，按 MDA、SOD、GSH試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)測(cè)定小鼠肝臟的蛋白質(zhì)含量（考馬斯亮藍(lán)法）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST、NO比較

2.2 各組小鼠肝組織勻漿MDA、SOD、GSH比較

表1 各組小鼠血清ALT、AST、NO比較（x±s）

表2 各組小鼠肝組織勻漿MDA、SOD、GSH比較（x±s）

3 討論

根據(jù)中醫(yī)理論，生理狀態(tài)下肝木能對(duì)脾土行使疏泄條達(dá)之能，脾胃之氣升降暢通，運(yùn)化水谷精微也可滋養(yǎng)肝木，構(gòu)成肝脾生理功能的協(xié)調(diào)。一旦肝失疏泄而肝氣郁結(jié)，橫逆犯脾，會(huì)導(dǎo)致脾胃虛弱，而脾胃功能的失調(diào)也影響了肝疏泄條達(dá)機(jī)能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中以四逆散方做為常規(guī)治療肝病的治肝方，四逆散是疏肝理氣的常用經(jīng)方，具有調(diào)理氣機(jī)，宣通郁滯，解郁開(kāi)結(jié)，益氣生新的功效，在臨床上常用于治療病毒性肝炎，近來(lái)亦有實(shí)驗(yàn)研究表明四逆散有良好的抗肝損傷作用［9-10］，而四君子湯是中醫(yī)傳統(tǒng)名方，具有健脾益氣之功效，常在肝病治療中做為實(shí)脾法運(yùn)用。而ConA誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷模型，被認(rèn)為能夠較好地模擬人類(lèi)病毒性肝炎等免疫性肝病的病理變化，常應(yīng)用于其發(fā)病機(jī)理及其治療藥物的作用機(jī)制研究［11-12］。本研究采用了ConA誘導(dǎo)的小鼠急性免疫性肝損傷模型，并以四君子湯方做為實(shí)脾法的代表方，同時(shí)設(shè)了一組四君子湯與四逆散的合方以探討肝病實(shí)脾法對(duì)急性肝損傷小鼠肝組織抗氧化能力是否具有保護(hù)作用。

血清中ALT和AST的水平是代表肝臟損傷的程度。NO在肝損傷過(guò)程中有雙重作用，研究表明：NO在肝損傷過(guò)程中早期可對(duì)肝臟起保護(hù)作用；但當(dāng)NO在肝臟中的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其生理濃度時(shí)，則其可通過(guò)抑制線粒體呼吸、抑制肝細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致肝細(xì)胞的DNA斷裂、肝組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞毒性損傷，間接改變細(xì)胞內(nèi)的cAMP含量、使肝細(xì)胞對(duì)TNF-α敏感性的提高等機(jī)制造成肝細(xì)胞損害、壞死。MDA是氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的重要的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可趨化中性粒細(xì)胞，還可導(dǎo)致致炎因子表達(dá)和釋放增加而產(chǎn)生炎癥，其水平高低反映了脂質(zhì)過(guò)氧化導(dǎo)致肝損傷的程度［13］。在本研究中模型組的小鼠血清中ALT、AST、NO及肝組織中的MDA水平較正常組、對(duì)照組顯著升高，說(shuō)明因ConA的誘導(dǎo)造成了小鼠嚴(yán)重的肝損傷。而四君子湯、四逆散、四君子湯合四逆散合方均使血清中ALT、AST、NO和肝組織中MDA水平降低，并且這4個(gè)指標(biāo)在3個(gè)治療組間也部分存在顯著性差異，說(shuō)明實(shí)脾法和疏肝理氣法對(duì)免疫性肝損傷中的ALT、AST、NO、MDA水平能起到降低的作用，而健脾益氣方與治肝方聯(lián)合使用時(shí)療效更為顯著，符合中醫(yī)的在肝病治療中同時(shí)運(yùn)用實(shí)脾法能提高療效的理論。

SOD和GSH都是肝組織中重要的抗氧化酶，在減輕肝組織過(guò)氧化損傷中起到重要作用。SOD能清除超氧陰離子自由基而保護(hù)細(xì)胞，是生物體內(nèi)第一道抗氧化防御體系。當(dāng)肝細(xì)胞受到自由基攻擊時(shí)，通過(guò)SOD與自由基作用而減少肝細(xì)胞的損傷。同時(shí)SOD還與體內(nèi)的第二道乃至更多的抗氧化防御體系有機(jī)的配合，以減少細(xì)胞損傷。GSH可直接通過(guò)供H＋拮抗氧自由基毒性，清除體內(nèi)的超氧離子及其他自由基，防止肝細(xì)胞損傷。因GSH具有強(qiáng)大的還原作用而使肝細(xì)胞膜對(duì)氧自由基的耐受性增加，從而保護(hù)肝細(xì)胞膜，使肝細(xì)胞膜穩(wěn)定性增加、肝酶降低。

本研究中小鼠肝組織的GSH水平與正常對(duì)照組相比，僅四君子湯合四逆散組有顯著降低，其余各組均無(wú)顯著差異，這可能與急性肝損傷所造成的免疫反應(yīng)時(shí)間尚短，體內(nèi)GSH消耗不太明顯有關(guān)。而健脾益氣方與治肝方聯(lián)合使用，能提高GSH的抗氧化能力，加速GSH的損耗，所以導(dǎo)致其GSH水平下降明顯，這可能也是健脾益氣方與治肝方聯(lián)合使用能有效降低ALT、AST、NO、MDA水平的原因。但在肝損傷持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的情況中，肝病實(shí)脾法能否提高肝臟中抗氧化酶的水平還需做進(jìn)一步探討。

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