同位素稀釋質譜法在臨床參考系統中的應用

全 燦，李紅梅

(中國計量科學研究院，北京 100029)

溯源性是通過具備證明文件的不間斷的校準鏈，將測量結果與參照物聯系起來的特性，校準鏈中的每項校準都會引入測量不確定度[1]。中國計量科學研究院位于校準鏈的頂端，簽署國際計量委員會互認協議(CIPM mutual recognition arrangement, CIPM MRA) ，通過國際比對，證明其測量能力，為參考物質賦值，為中間層級參考實驗室測量結果提供溯源，從而為常規實驗室間質量評價的質控品賦值提供溯源[2]。

參考測量程序經過充分研究，其測量值的測量不確定度適合其預期用途，尤其用于評價測量相同量的其他測量程序的正確度。同位素稀釋質譜法(isotope dilution mass spectrometry, IDMS)作為具有最高計量學特性的基準方法，用高豐度同位素標記物作為內標，適用于可直接或用其衍生物進行質譜分析的測量，已廣泛應用于臨床參考系統[3-4]。本文重點介紹了同位素稀釋質譜基本原理、定量方式及其不確定度，結合檢驗醫學溯源聯合委員會 (joint committee for traceability in laboratory medicine, JCTLM)參考系統數據庫，分析其在臨床參考系統的應用及最新進展。

1 臨床檢測結果溯源性及參考系統

1.1 臨床檢測結果溯源性

醫學診斷及其治療都依賴于臨床檢測指標的準確可靠。臨床上有近4 000項檢測項目，涵蓋不同的相對分子質量、濃度范圍、形態和基體。臨床檢驗已成為疾病診斷、治療效果評價和健康狀況監測的重要手段，臨床檢測結果的一致性和可比性是防病治病和提高人類健康水平的基本要求。臨床檢測結果關系患者、門診醫生、檢驗科、病理科專家、儀器廠家以及醫療管理部門等諸多相關方的利益。檢測結果受“人、機、料、法、環”等因素影響。

國際計量局(bureau international des poids et mesures, BIPM)、聯合國際法制計量組織(international organization of legal metrology, OIML)、國際實驗室認可合作組織(international laboratory accreditation cooperation, ILAC)，以及國際標準化組織(international organization for standardization, ISO)發布《BIPM，OIML，ILAC，ISO對計量溯源性聯合聲明》[1]，明確提出測量結果一致性和可比性是檢測結果的基本需求，只有實現可比，檢測結果方可被普遍采納。溯源性是關于測量結果的屬性，使測量結果通過連續的比較鏈與給定的參考標準聯系起來，具有一致性和可比性，給定的參考標準通常是國家或國際標準，是實現國際等效的保證。比較鏈中每一步都有給定的不確定度，溯源源頭可以是國際單位制(international system of units, SI)或國際公認其他參考標準。

1.2 臨床參考系統

患者新鮮樣品檢測結果的可溯源性是建立臨床參考系統的主旨和最終目標。溯源性的基礎是參考系統，包括參考物質、測量程序和參考實驗室。參考系統應具有國際公認的計量學水平。一級參考物質(primary reference material, PRM)是指用基準方法或二種不同原理的方法定值，具有最高計量學水平，一般是純度標準物質。目前，一級參考測量程序(基準方法)僅限于同位素稀釋/質譜(ID/MS)、庫侖法、重量法、滴定法和依數性(如凝固點降低)測量等[5]。國際上臨床檢驗項目能溯源至SI單位的約有25～40個，如電解質類物質(如鉀、鈉、氯、鎂、鈣、鋰離子等)、代謝物類物質(如膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、肌肝、尿酸、尿素等)和某些甾體類激素及甲狀腺激素等，雖數目不大，卻是臨床檢驗常規項目的主要組成部分。其余多因測量(主要是生物大分子類物質)的復雜性(如混合物、異構體等)，使得一級參考測量過程的建立和一級參考物質的制備困難，量值溯源停留在較低水平[4,6]。臨床上標記常用的主要穩定同位素列于表1，包括碳、氫、氧、氮等元素。

表1 臨床上常用的穩定同位素Table 1 Frequently-used stable isotopes in clinic

2 IDMS基本概念、溯源性原理

2.1 IDMS溯源性原理

基準方法，亦稱絕對方法或定義測量方法(primary/absolute/definitive method)，其定義為具有最高計量學特性的測量方法。其操作可以被完整描述和理解，不確定度可以用SI單位表述，其測量值不需要參考相同量的其他標準。具有被測量定義明確、高度特異性、不確定度分量及其影響因素清晰、最小的不確定度和最高的計量學水平等特征，常由中國計量科學院建立。根據基準方法的特征，國際物質量咨詢委員會(committee for amount of substance: metrology in chemistry and biology, CCQM)確定了化學領域五種基準方法，包括同位素稀釋質譜法、庫侖法、重量法、滴定法以及如凝固點下降法等其他依數性測量方法[5,7-9]。同位素稀釋質譜法原理是向被測樣品中加入一定量的同位素，通過質譜測定同位素豐度比進行定量[8]，其主要過程為：精確稱量一定質量的被測樣品，配制成一定濃度Cs的樣品溶液，同時精確稱量一定質量的高純度同位素配制成濃度Cl的同位素溶液，將兩者混合成一定同位素豐度比的混合標準溶液，經充分混合平衡后進行質譜檢測，根據測得的同位素豐度比和質量比按一定模式進行定量。

2.2 IDMS 基準方法定量方式

IDMS 基準方法定量方式主要包括單點法、括弧法以及線性法/校準曲線法，分述如下。

2.2.1單點法 精確配制1個校準混合溶液，同位素比約為1.0，計算公式如式(1)所示：

(1)

式中，Rwsample、Rwstandard分別指樣品和混合標準溶液中的同位素質量比；RAsample、RAstandard分別指樣品和混合標準溶液中的同位素豐度響應比。單點法要求配制的校準混合溶液以及樣品中添加的同位素質量比盡可能接近1，適合經預實驗后得到樣品大致濃度需要精確定量的情況，具有制備樣品量少的優點。

2.2.2括弧法 需要配制高標、低標2個校準混合溶液，同位素豐度比約為1.00，如(0.95～1.05) ，按比例法定量，計算公式如式(2)所示：

(2)

式中，C為待測樣品中被測量的濃度，mg/kg；Rs為待測樣品中同位素豐度比；Rl為低標樣品中同位素豐度比；Rh為高標樣品中同位素豐度比；Wh為高標樣品中同位素質量比；Wl為低標樣品中同位素質量比；Mlab為待測樣品添加的標記質量，g；Mser為待測樣品中被測量的質量，g；PS為被測量高純物質(如純度標準物質)的純度。

括弧法亦稱比例法，是在接近樣品被測量濃度附近范圍配制高標和低標混合校準溶液。同樣適合經預實驗后得到樣品大致濃度需要精確定量的情形，可以通過多次實驗，不斷收緊高標、低標范圍，具有定量準確的優點。按低標→樣品A→樣品B→高標→樣品A→樣品B→低標的次序進樣，要求相鄰兩次進樣的檢測結果變異系數CV<1%，否則需要再增加進樣次數，直至滿足要求。

2.2.3線性法 亦稱校準曲線法，是在樣品被測量濃度范圍配制系列校準混溶液(5～9個同位素質量比，如0.85～1.25)，在一定范圍內校準混合溶液中同位素質量比(RW)與同位素豐度比的線性相關性，如公式(3)所示，從而回歸擬合得到樣品中被測量的濃度：

RW=a+bRA

(3)

線性法適合對被測樣品經預實驗確定大致濃度范圍的情形，也適合對樣品進行精確定量的情形，具有定量可靠的優點。但線性法在精確定量時要求配制的混合校準溶液較多(5～9個)，樣品配制工作量大，特別是有多個被測量的情況，且要求線性相關系數r>0.999 9，以保證定量結果的可靠性，此外，線性不確定度分量也需要評定。

2.3 不確定度評定

作為基準方法，IDMS具有最高的計量學特性，即具有最低的不確定度。根據IDMS溯源原理，主要包括重量法配制和質譜法檢測兩個環節，相應的合成不確定度uC評定依據公式(4)：

uC=

(4)

總體分為A類不確定度和B類不確定度，其中A類不確定度是使用統計分析法評定，而B類不確定度是根據經驗或其他信息，不使用統計分析法進行評定。樣品溶液、同位素溶液以及混合校準溶液通常均采用重量-重量法配制，需要在控制實驗室環境條件下使用高精密度天平準確稱量。稱重過程不確定度分量需要考慮天平浮力、線性、靈敏度、樣品水分、穩定性以及稱量重復性等因素影響。樣品制備過程中萃取、混合平衡常常很難保證添加的同位素標記物與樣品中的被測量物充分平衡，需要對樣品處理過程優化，確保兩者充分平衡。可通過樣品添加研究評估回收率，即添加已知量的被測物至待測樣品中，充分平衡后使其盡可能與被測樣品接近。質譜響應主要受基質干擾、質量歧視、豐度靈敏度以及響應重復性等因素影響。在評定測量結果不確定度時，還應考慮樣品的均勻性、萃取效率、分析空白、干擾影響、回收率等不確定度分量對合成不確定度的影響。

3 IDMS在臨床參考測量系統上的應用

3.1 國際檢驗醫學溯源聯合委員會

國際檢驗醫學溯源聯合委員會是由國際計量局、國際臨床化學與檢驗醫學聯合會(international federation of clinical chemistry and laboratory medicine, IFCC)和國際實驗室認可合作組織(international laboratory Accreditation cooperation, ILAC)共同組織成立，秘書處設在國際計量局。旨在“指導和促進世界公認的醫學檢驗等效測量，為檢驗醫學測量標準溯源提供全球平臺”。其任務就是指導和促進世界公認的醫學檢驗等效測量，實現檢驗醫學測量結果的可溯源性，提供全球平臺。核心工作就是鑒別和遴選急需關鍵檢驗指標的可溯源性和可比性，鼓勵利益攸關方參與建立參考系統。

3.2 JCTLM 數據庫[10]

根據最新統計數據：截至2017年3月，JCTLM 數據庫共收錄了293 種參考物質，184 種參考測量程序和由17個參考實驗室提供的161種參考測量服務。

3.2.1參考系統完整 具備三位一體的參考物質(包括純度參考物質和基體參考物質)、參考測量程序和參考測量服務。目前JCTLM 數據庫共有26個完整的參考系統，包括17 beta-雌二醇、孕酮、睪酮、可的松、膽固醇、血清肌酐、甘油三酯、血中尿素、血中尿酸、地高辛、γ-谷氨酸、HDLLDL 13種有機小分子；鈣、鎂、鉀、鈉、鋰、氯離子6種無機電解質；以及丙氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、α-淀粉酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、肌酸激酶、乳酸脫氫酶、糖化血紅蛋白7種酶及蛋白。上述13種有機小分子和6種無機電解質基于同位素稀釋質譜技術參考測量程序。

3.2.2尚待完善 參考系統三要素中只有兩個，還缺少一個要素。目前數據庫中有39種尚待完善的參考系統，包括基于同位素稀釋質譜法建立了參考測量程序的羥孕酮、羥基雌酮、VD2、VD3、甲基四氫葉酸、醛固酮、膽紅素、洋地黃毒苷、雌三醇、甲狀腺素、魯米那、苯妥英、茶堿、T3T4、尿中(肌酐、葡萄糖、尿素、尿酸)等19種有機小分子和砷、鎘、鈷、銅、鉛、汞等10種無機電解質；此外還有白蛋白、C 肽、CRP、IgGIgAIgM、轉鐵蛋白、transthyretin等10種大分子蛋白參考系統需要完善。

3.2.3單一要素的參考系統 目前只有其中一個要素的參考系統，共計140種，包括63種只有純度或溶液參考物質，其中包括21種校準溶液和42種純度參考物質；60種只有基體參考物質，包括4種血漿基質、27種血清基質和29種尿液基質。17種只有參考測量程序，包括11種血清基質、3種全血基質、2種血漿基質、1種腦脊液基質和1種尿液基質。

3.3 我國在臨床參考系統方面的研究[11-13]

近年來，臨床參考系統研究在國內發展迅速，目前主要是中國計量科學研究院等機構代表參加JCTLM的年會，在BIPM JCTLM中發揮積極作用，臨床領域參考物質被JCTLM參考物質數據庫收錄。中國計量院研究人員作為評審專家或組長在JCTLM工作組中發揮著積極作用。

中國計量科學研究院基于IDMS基準方法，成功參加了系列臨床領域國際比對。建立了LC-IDMS測定血清中肌酐準確定值方法，2005年6月參加了血清中肌酐國際比對CCQM-K12.1。建立了直接蛋白沉淀-低溫離心的LC/MS電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)，建立了液相色譜-同位素稀釋質譜(LC-IDMS)準確測定血糖的方法，2013年參加了CCQM-K11.2血清中葡萄糖國際比對，取得了很好的比對結果，在所有實驗室中成績最好，實現了國際互認和等效一致，并對兩種絕對方法進行了比較。建立了LC-IDMS測量血清中睪酮含量的高準確度方法，采用萃取和沉淀等前處理方法從血清中提取睪酮，以13C標記睪酮為內標，同時考察樣品前處理過程的影響，2016年6月參加的國際臨床化學和實驗室醫學聯盟(IFCC)血清中睪酮含量測定國際比對中取得了良好成績。2017年3月參加了國際計量比對計劃(CCQM-K78)，測定水溶液中苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸四種氨基酸的含量。利用液相色譜同位素稀釋質譜法，以氨基酸相對應的同位素標記物為內標，準確測定了四種氨基酸的含量，實現了亮氨酸和異亮氨酸同分異構體的完全分離。中國計量科學研究院大部分臨床參考物質均采用IDMS基準方法進行定值，如膽固醇、肌酐、葡萄糖、可的松、激素等被測量定義明確的小分子化合物，可溯源至SI。

4 小結

測量結果一致性和可比性是臨床檢驗結果互認的基本需求，只有實現可比，測量結果方可被普遍接受。溯源性是測量結果一致性和可比性的保證，臨床參考系統是實現臨床結果溯源性的技術途徑。IDMS是一項基準方法，具有最高的計量特性，在臨床參考系統方面有著廣泛的應用，如用于參考測量程序的建立，血清基體標準物質的定值以及國際比對等。

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