高效液相色譜法測定山楂黃酮的研究

李博藝，諶柄旭，魏志陽，王希彬，肖冬光*

（天津科技大學 生物工程學院 天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）為薔薇科山楂屬植物果實，又稱山里紅、山楂果、山梨、紅果等[1-2]，在我國北方地區廣泛栽培，是重要的藥食同源植物。中國傳統醫學認為山楂具有消食健胃，行氣散瘀，化濁降脂的作用；現代醫學研究表明，山楂具有促進消化酶分泌，調節胃腸平滑肌、抗氧化、降血壓、降血脂、抑菌等藥理活性[3]。山楂中主要的生物活性成分包括黃酮類化合物、原花青素、三帖酸等[4-8]，目前從山楂中已分離得到60余種黃酮類化合物[9]。

山楂黃酮檢測方法中，NaNO2-AL（NO3）3比色法是應用最廣泛的[10]，樣品以蘆丁作為對照標準品，顯色后在波長500～510 nm處測定總黃酮含量[11-13]，使用比色法檢測山楂黃酮總含量在10～70 g/kg之間[14-16]。郭亞健等[17]通過篩選發現某些黃酮類化合物，如槲皮素、山柰素、黃芩素等在波長500～510 nm范圍內無最大吸收或吸收較弱，而某些非黃酮類化合物如咖啡酸、綠原酸等卻在該處有最大或較強吸收，在應用中可能造成黃酮類化合物假陰性和非黃酮類化合物假陽性干擾，方法專屬性不強；同時黃酮類物質分類較廣，種類繁多，一概以蘆丁為對照品進行比對，檢測結果誤差較大。

液相色譜法將樣品中單體物質分離檢測，可以有效消除酚酸類物質對黃酮含量檢測造成的影響[18-22]。孫立立等[23]對比色法測定山楂總黃酮含量與液相法測定山楂中金絲桃苷含量進行了對比；張永超等[24]使用高效液相色譜法對山楂中蘆丁與槲皮素檢測進行了方法學考察；陳寶龍等[25]采用高效液相色譜法建立了山楂藥材黃酮類成分指紋圖譜；王珍等[26]建立了全波長高效液相色譜法測定山楂總黃酮提取物中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量的方法。但在山楂黃酮類物質檢測中，還存在色譜分離效果不好，準確定量分析方法未完善等不足。本研究對高效液相色譜（high performanceliquid chromatograph，HPLC）測定山楂中主要黃酮類物質的方法進行了優化，建立定性定量檢測牡荊素、蘆丁和槲皮素的方法，并對五個不同地區山楂樣品中的主要黃酮類物質進行了分析檢測，研究不同山楂果實中黃酮含量差異，旨在為山楂黃酮定量檢測提供參考，為山楂資源綜合利用、資源評價及深度開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：分別購于天津、山西運城、河北邯鄲、山東蒙陰山、山東萊蕪；牡荊素、蘆丁、槲皮素標準品（純度均＞99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高效液相色譜檢測所需試劑均為色譜純，其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HPLC-UV高效液相色譜儀：美國Agilent公司；FA2204B電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 山楂黃酮的提取

采用回流提取法[20]提取山楂黃酮類化合物：準確稱取山楂細粉樣品0.500 0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入體積分數60%乙醇50 mL，稱質量，水浴回流提取4 h，冷卻至室溫，稱質量，補充損失的溶劑質量（精確至0.001 g），搖勻，使用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，濾液即為山楂黃酮提取液，備用。

1.3.2 色譜柱柱溫的選擇

高效液相色譜條件為：色譜柱Cosmosil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相A 100%甲醇，流動相B 1%乙酸；流速0.6mL/min；檢測波長360nm，進樣量20μL。分別在30℃、40℃、50℃柱溫下，對山楂黃酮提取液進樣分析，記錄高效液相色譜圖并進行對比。

1.3.3 梯度洗脫流程的確定

色譜條件同1.3.2，柱溫30℃，梯度洗脫流程見表1，按4種梯度洗脫流程對山楂黃酮提取液進樣分析，從而確定最佳梯度洗脫流程。

表1 不同HPLC流動相梯度洗脫時間表Table 1 Gradient elution schedules for different HPLC mobile phases

1.3.4 標準溶液的制備

準確稱取牡荊素0.010 0 g、蘆丁0.020 0 g和槲皮素0.020 0 g，分別用甲醇溶解定容至50 mL容量瓶中，得到標準儲備液，按表2稀釋成不同質量濃度的標準使用液。

表2 混合標準溶液中各標準品的質量濃度Table 2 Concentration of each standard substance in the mixed standard solution

1.3.5 不同地區山楂黃酮相似度分析

取5個不同地區山楂樣品，按1.3.1方法制備山楂黃酮提取液，并按照優化后液相色譜檢測方法進行分析，記錄液相色譜圖。運用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”對5組山楂黃酮樣品的液相色譜圖進行分析。

2 結果與分析

2.1 色譜柱柱溫的選擇

按1.3.2的方法，在柱溫為30℃、40℃、50℃條件下，對山楂黃酮提取液進行分析得色譜圖，結果見圖1。由圖1可知，隨著柱溫的升高，柱壓下降，洗脫效率增強，幾種物質出峰時間均有所提前。在40℃和50℃時，色譜圖在20～30 min間出峰過于密集，不利于各種物質的分離辨別，對比色譜圖的分離效果，確定30℃為最佳柱溫。

圖1 不同柱溫山楂樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of hawthorn sample with different column temperature

2.2 液相色譜梯度洗脫流程優化

按照1.3.3中的方法，以4種梯度洗脫流程對供試樣品進樣分析，色譜圖見圖2。由圖2可知，流程Ⅰ起始水相比例較高，牡荊素峰與雜質峰混在一起，無法分離；隨著起始有機相比例的升高，流程Ⅱ、流程III、流程IV中物質的出峰時間逐漸提前，20～30 min之間物質出峰也更加密集，在流程Ⅱ中，牡荊素與雜峰分離效果較好，色譜基線更加平穩，讀取數據更加準確。所以選擇流程Ⅱ為山楂黃酮檢測梯度洗脫流程。

圖2 不同流動相梯度洗脫程序高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of different mobile phase gradient elution procedures

2.3 外標法測定山楂中主要黃酮含量

山楂黃酮提取液與標準溶液的色譜圖見圖3，對照標準品色譜圖，山楂樣品液在相同保留時間出現了牡荊素、蘆丁、槲皮素的色譜峰，且峰形較好。

圖3 3種對照標準品混合溶液(A)和山楂樣品(B)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of 3 mixtures standard solutions(A)and hawthorn sample(B)

按表2制備不同質量濃度的標準溶液，分別進樣20μL，按照優化后液相色譜條件進行測定，以進樣量對色譜峰面積進行最小二乘法線性回歸，分別建立各標準品的回歸方程，結果見表3。由表3可知，牡荊素、蘆丁、槲皮素的保留時間分別為25.59 min、30.76 min和46.68 min，回歸方程的線性范圍分別為1～100 mg/L、1～120 mg/L和1～40 mg/L，相關系數在0.999 2～0.999 7，表明線性關系較好，3種黃酮的檢出限為0.020～0.082 mg/L，定量限為0.065～0.253 mg/L。

表3 標準品的保留時間、線性回歸方程、相關系數和線性范圍(n=6)Table 3 Retention time,linear regression equation,correlation coefficient and linear range of standard substances(n=6)

2.4 方法學考察

2.4.1 重復性試驗

準確稱取山楂樣品，按照1.3.1的方法制備山楂黃酮提取液，采用優化后的色譜條件測定山楂中三種主要黃酮含量，6次平行試驗結果見表4。由表4可知，各共有峰相對保留時間的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均＜5%，三種主要黃酮含量的RSD均＜5%，表明該方法重復性良好，符合定性定量檢測要求。

表4 重復性實驗結果Table 4 Results of repeatability tests

2.4.2 穩定性試驗

精確稱取樣品，按照1.3.1的方法制備山楂黃酮提取液，分別放置0、1 h、2 h、4 h、8 h后進行高效液相色譜測定，實驗結果見表5。由表5可知，各黃酮含量的RSD均＜5%，表明山楂黃酮提取液在8 h內穩定。

表5 穩定性試驗結果Table 5 Results of stability tests

2.4.3 回收率試驗

準確稱取已知黃酮含量的同一批山楂樣品3份，每份約0.500 0 g，加入與樣品中含量大致相等的標準品，按1.3.1操作，制備山楂黃酮提取液，依優化后色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表6。由表6可知，三種物質加標回收率在99.63%～104.76%之間，相對標準偏差（RSD）值均低于5%，符合定量檢測要求。

表6 加標回收率實驗結果（n=3）Table 6 Results of adding standard recovery rate（n=3）

2.5 不同地區山楂主要黃酮含量的檢測

2.5.1 不同地區山楂黃酮類物質液相色譜圖相似度分析

按1.3.5方法，對5組山楂黃酮樣品的液相色譜圖進行分析，設定河北邯鄲樣品為參照圖譜，選取“時間窗寬度”為0.1 min，采用中位數法計算，選定3個特征峰進行多點校正，自動匹配，生成山楂黃酮成分的對照指紋圖譜，見圖4，匹配后的5批樣品色譜圖見圖5。由圖5可知，五個不同地區山楂樣品均有牡荊素、蘆丁和槲皮素的色譜峰，且均以蘆丁為主要黃酮物質。

圖4 山楂標準品的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of hawthorn standard

以對照指紋圖譜為參照，進行各樣品的相似度評價，5個不同地區山楂樣品相似度關系見表7。由表7可知，五組樣品與對照色譜圖譜相似度在0.772～0.993，說明各產地的山楂樣品差別較大；另一方面，來自于山東省的兩個山楂樣品（S1、S2）和來自于天津和河北的兩個山楂樣品（S3、S5）相似度分別為0.938和0.996，說明產地相近的山楂樣品相似度較高。

圖5 5個不同地區山楂樣品高效液相色譜指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprint of hawthorn samples in five different regions

表7 5個不同地區山楂樣品高效液相色譜圖相似度結果Table 7 Similarity results of hawthorn samples in five different regions by HPLC

2.5.2 不同地區山楂樣品主要黃酮含量測定

對5個不同地區山楂的黃酮類物質進行定量分析，結果見表8。由表8可知，不同地區山楂主要黃酮類物質總量相差較大，最高的是山東蒙陰山山楂（897.80 mg/kg），最低的為天津山楂（420.47 mg/kg），其中牡荊素和槲皮素的含量差別較小，而蘆丁的含量差別較大，山東地區山楂中蘆丁的含量約為天津地區的4倍。

表8 不同地區山楂黃酮含量測定結果Table 8 Determination results of hawthorn flavonoids in different regions mg/kg

3 結論

通過對高效液相色譜測定山楂黃酮方法的優化，建立了外標法定量測定山楂中牡荊素、蘆丁和槲皮素含量的方法，方法學驗證結果表明，重復性試驗RSD為1.73%，穩定性試驗RSD為1.04%，加標回收率為99.63%～104.8%，說明此方法重復性高，穩定性好，具有較好的準確性。

對5種不同地區山楂樣品黃酮類物質色譜圖的相似度分析，結果表明不同地區山楂黃酮類物質組成相差較大，受到地域環境條件、成熟度、采摘年份等多種因素影響，山楂黃酮的組成和含量都可能存在較大的差別，其中蘆丁含量的差別最為明顯。

本研究采用高效液相色譜法檢測山楂中三種主要黃酮的總量僅為420.47～897.80 mg/kg，與比色法所測的黃酮總量相差較大。分析原因主要包括兩個方面：一是目前從山楂中已分離得到黃酮類化合物有60余種，而本方法僅定量分析了其中三種主要的黃酮；另一方面，比色法的測定原理為利用類黃酮結構上的酚羥基特征及其還原性進行顯色，只要有鄰二羥基或有3,5位羥基結構的化合物，都會與NaNO2-AL（NO3）3顯色劑發生顯色反應，對黃酮而言顯色劑NaNO2-AL（NO3）3并不具有專屬性，而許多酚酸類物質也含有類似結構，從而導致山楂總黃酮檢測結果的數據偏大。如何準確定量測定山楂總黃酮含量，有待進一步研究。

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