HPLC法檢測黑曲霉發酵液中5-羥甲基糠醛的研究

張 素，吉玉玉，肖 洋，陳家祥，徐 策，李 祝*

（1.貴州省煙草公司畢節市公司，貴州 畢節 551700；2.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州省產品質量檢驗檢測院，貴州 貴陽 550003）

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl-furfural，5-HMF），也稱5-羥甲基-2-呋喃甲醛，是葡萄糖、果糖等單糖化合物在高溫或弱酸等條件下脫水產生的醛類化合物[1-2]，其分子中含有活潑基團醛基和羥甲基，可作為許多化學品的反應中間體，有望成為新的平臺化合物[3]。目前5-羥甲基糠醛的制備方法主要是生物質水解法[4]，還可通過降解植物纖維素制備[5]。于能江[6]從頭孢霉屬（Cephalosporium sp.）GH10的發酵物中分離鑒定出5-HMF，陳楠等[7]以蜜環菌發酵液為原料優化5-HMF的提取工藝皆能證明微生物發酵液產5-HMF，但都未對其含量進行精確的測定。國內外針對牛乳、果汁、蜂蜜、谷類食物、酒類和藥物中5-HMF的檢測方法進行了大量的報道，主要包括紫外分光光度法[8]、衍生化分光光度法[9]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法等[10-11]。紫外分光光度應用在乳制品中，由于含有多種蛋白質等成分會對分析結果有影響；衍生化分光光度法需先生成衍生化產物后再進行測定，耗時較長且操作較繁瑣[12]。高效液相色譜法因具有樣品用量少、方法操作簡單并且能夠準確對單一組分進行定性和定量等優點而被廣泛使用[11]。本實驗以黑曲霉（Aspergillus niger）發酵液為原料，以滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基為空白對照，用高效液相色譜法對5-HMF含量進行測定，對于探索黑曲霉發酵液中存在物質具有一定的參考作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillusniger）xj：貴州大學真菌資源研究所分離，保藏于中國典型培養物保藏中心，CCTCC NO：M206021。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）：天津富宇試劑公司；無水乙醇、冰乙酸（均為分析純）：天津恒興試劑公司；超純水：實驗室自制；5-HMF對照品（純度為99.9%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Agilent-1100型高效液相色譜儀（配有四元梯度泵，二極管陣列檢測器，在線真空脫氣機）：美國Agilent公司；ME203T電子分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；Exceed-E超純水機：成都康寧實驗專用純水設備廠。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜條件參照劉超等[13]測定糠醛的方法。色譜條件：Spheriorb C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸調）=15∶85（V/V）為流動相，柱溫30℃；流速1 mL/min，檢測波長λ=277 nm，進樣量10μL。

1.3.2 發酵液浸膏及培養基的處理

將黑曲霉發酵液浸膏10 g用150 mL沸水進行抽提8 h、10 000 r/min離心15min取上清液。上清液用300 mL乙醚萃?。ǚ?次進行，萃取后得到200 mL乙醚），將得到乙醚自然揮干，再用6 mL甲醇溶解后12 000 r/min離心2 min取上清液，經0.45μm濾膜過濾后進行HPLC分析[13]。將滅菌后的10 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基同樣方法處理。

1.3.3 標準曲線的繪制

精密稱取5-HMF標準品適量，制成1 mg/mL的體積分數為90%甲醇溶液，作為標準貯備液。精密吸取標準貯備液適量，分別稀釋為1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL的標準工作液，按照1.3.1的條件進樣。以5-HMF標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標制作5-HMF標準曲線。

2 結果與分析

2.1 標準曲線及線性關系的考察

圖1 5-羥甲基糠醛標準曲線Fig.1 Standard curve of 5-hydroxymethyl-furfural

以5-HMF標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標制作5-羥甲基糠醛標準曲線，結果見圖1。由圖1可知，5-HMF標準曲線線性回歸方程為y=51.628x+72.335，相關系數R2=0.999，5-HMF質量濃度在1～50μg/mL范圍內與峰面積具有良好的線性關系，能夠滿足樣品測試要求。

2.2 精密度實驗

取20μg/mL的5-HMF對照品溶液，按1.3.1節高效液相色譜條件連續進樣8針，得到對照品峰面積，精密度實驗結果見表1。由表1可知，5-HMF質量濃度測定結果的相對標準偏差（relative standaral deviation，RSD）值為0.71%，結果表明該方法精密度高。

表1 精密度實驗結果Table 1 Results of precision experiments

2.3 重復性實驗

平行取同一批次發酵液6份，按1.3.3節制備供試品溶液6份，按1.3.1節色譜條件進樣，得到對照品峰面積，重復性實驗結果見表2。由表2可知，5-HMF含量測定結果RSD值為0.98%，表明該檢測方法重復性良好。

表2 重復性實驗結果Table 1 Results of repeatability experiments

2.4 回收率實驗

精密稱取已知含量的發酵液9份，分別按照低、中、高3種濃度水平加入對照品溶液適量，按1.3.3節中方法處理后，各濃度水平平行測定3次，結果見表3。由表3可知，樣品平均加標回收率在87.12%～90.78%，表明該方法準確度良好。

表3 加標回收率實驗結果Table 3 Results of adding standard recovery rate experiments

2.5 樣品中5-羥甲基糠醛含量高效液相色譜檢測

5-羥甲基糠醛標準品高效液相色譜圖見圖2。由圖2可知，5-HMF的保留時間為2.436 min。

圖2 5-羥甲基糠醛標準品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethyl-furfural standard substance

黑曲霉發酵液樣品中5-HMF含量分析高效液相色譜圖見圖3。由圖3可知，5-HMF的保留時間為2.405 min左右，計算黑曲霉發酵液樣品中5-HMF含量為0.127 5 mg/g。

圖3 黑曲霉xj發酵液樣品中5-羥甲基糠醛含量高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethyl-furfural content in fermentation broth of A.niger xj

PDA培養基樣品中5-HMF含量分析高效液相色譜圖見圖4。由圖4可知，5-HMF的保留時間為2.407min，計算PDA培養基樣品中5-HMF含量為0.001 8 mg/g。所以黑曲霉發酵液中5-HMF凈含量為0.125 7 mg/g。

圖4 PDA培養基樣品中5-羥甲基糠醛含量高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of 5-hydroxymethyl-furfural content in PDA medium

3 結論

本實驗確定了HPLC快速檢測黑曲霉發酵液中5-HMF含量的條件：采用Spheriorb C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以乙睛∶0.1%乙酸水（冰乙酸調）=10∶90（V/V）為流動相，柱溫30℃；流速1 mL/min，波長λ=277 nm，進樣量10μL。其保留時間為2.436min，回收率為87.12%～90.78%，精密度實驗結果RSD為0.71%。發酵液樣品中5-HMF含量為0.125 7 mg/g。

本實驗旨在建立黑曲霉發酵液中5-HMF含量的檢測方法。通過對發酵液的分離提取，結合優化的液相色譜條件，5-HMF獲得了良好的分離效果。采用HPLC法準確、方便，且可對黑曲霉發酵液中5-HMF的測定提供很好的依據，重復性好，實用性較強，對于探索黑曲霉發酵液中物質有著一定的參考作用。

參考文獻：

[1]JUBEN N C,GEORGE W H,JAMESA D.Liquid-phase catalytic processing of biomass-derived oxygenated hydrocarbons to fuels and chemicals[J].Angewandte Chem,2007,46(38)：7164-83.

[2]CHHED A,JUBEN N.Production of 5-hydroxymethylfurfural and furfural by dehydration of biomass-derived mono-and polysaccharides[J].Green Chem,2007,9(4)：342-350.

[3]王 軍，張春鵬，歐陽平凱.5-羥甲基糠醛制備及應用的研究進展[J].化工進展，2008，27（5）：702-707.

[4]KUSTER B M F.5-hydroxymethylfurfural(HMF),a review focusing on itsmanufacture[J].Starch,1990,42(8)：314-321.

[5]吳樹昌，王春雷，高勇軍，等.離子液體中微波輔助的Lewis酸催化纖維素制備 5-羥甲基糠醛[J].催化學報，2010，31（9）：1157-1161.

[6]于能江.兩種真菌的次生代謝產物和生物活性研究[D].北京：中國協和醫科大學，2002.

[7]陳 楠，焦連慶，鄭毅男，等.蜜環菌發酵液中5-羥甲基糠醛提取工藝優化[J].特產研究，2012，34（1）：31-33，46.

[8]李 良，孟淑潔，陳曉云，等.水果蔬菜及其制品中羥甲基糠醛測定的研究[J].遼寧農業科學，2002（4）：12-14.

[9]TU D,XUE S,MENG C.Simultanous determination of 2-FUR and 5-HMF by deriva-tivespectrophotometry[J].Agr Food Chem,1992,40(6)：1022-1025.

[10]FERRERE,ALEGRIA A.High-performace liquid chromatography determination of Maillard compounds in store-brand and name-brand ultra-high-temperature-treated cows'milk[J].Chromatogr A,2000,881(1-2)：599-606.

[11]MORALESFJ,ROMEROC,JIMENEZ PS.An enhanced liquid chromatographic met-hod for 5-hydroxymethyfurfural determination in UHT milk[J].Chromatographia,1992,33(1/2)：45-48.

[12]ESPINOSA-MANSILLA A,MUNOZ DE LA PANA A,SALINASF.Semiautomatic determination off uranic aldehydesin good and pharmaceutical samplesby astopped-flow injection analysismethod[J].AOAC Int,1993,76(6)：1255-1261.

[13]劉 超，方尚玲，李 習，等.HPLC法測定產醬香芽孢桿菌發酵液中糠醛的含量[J].釀酒，2012，39（4）：46-49.

[14]龍光明，裘 璐，馬 麗，等.HPLC測定6種蜂蜜中5-羥甲基糠醛的含量[J].數理醫藥學雜志，2012，25（6）：643-645.

[15]王妙飛，張水華，郭新東，等.高效液相色譜法測定醬油中的5-羥甲基糠醛[J].現代食品科技，2008，24（2）：188-190.

[16]梁 多，劉智鈞，肖婉娜.HPLC法同時測定青梅精中梅素和5-羥甲基糠醛[J].農產品加工，2017（1）：57-59，65.

[17]周 堅.HPLC法測定小活絡丸（大蜜丸）中5-羥甲基糠醛的含量[J].西北藥學雜志，2013，28（1）：34-35.

[18]張清波，喬 菲，陳曉雪，等.HPLC測定熟地黃中5-羥甲基糠醛的含量[J].中國藥品標準，2001，2（4）：33-34.