海洋放線菌（Salinispora arenicola）基因轉移系統的建立

馬艷玲，李海賢，翁 萍，劉澤璇，許小慶，曾 榮*

（佛山科學技術學院 食品科學與工程學院，廣東 佛山 528231）

天然藥物的一個重要來源是海洋放線菌[1]，其作為一類特殊菌群其可以產生多種生物活性物質，這些活性物質很多都具有成為新藥先導化合物的研制潛能，如多肽、酶類、抗腫瘤物質和抗生素等[2-4]。隨著抗生素的廣泛應用，各種病原微生物的耐藥性不斷增強，解決該問題最直接的解決方法就是開發新型抗生素類藥物。但是近幾年發現，通過天然藥物篩選來開發新型藥物的難度越來越大，因此如何采用新的技術，通過新資源的篩選來開發新型藥物已成為當代天然藥物開發中亟待需要解決的重要問題[5]。海洋放線菌由于其生活環境的特殊性—高壓、高鹽、低氧、低溫、寡營養和低光照，導致其在長期進化中代謝過程發生了巨大改變，為了適應不良環境在其代謝過程中會形成一系列活性特別而且結構特殊的生物活性物質[6-7]。曾經一度有人認為，海洋微生物來源于陸地，因此，在代謝產物上海洋微生物的代謝產物與陸地上的微生物相比并沒有特殊性，直到一系列新型化合物fijimycinsA-C和etamycin A和salinosporamide A的發現直接顛覆了前人的想法，有力的證明了海洋微生物與陸生微生物相比具有其特殊性，從此，海洋成為了一個藥物開發的寶貴資源庫[8-13]，直接改變了前人曾質疑海洋微生物的代謝物質具有新穎性的想法[14]。2006年人類首次發現了第一個專屬性海洋放線菌——鹽孢菌屬（Salinispora），該菌株必須依賴海水才能正常生長，并且可以產生一系列聚酮化合物[15]。2007年研究學者首次對該海洋放線菌完成了基因組測序[16]。2009年已發現的專屬性海洋放線菌的數量已達到22個[17]。2010年又從海洋中發現50個放線菌屬，其中12個屬于首次發現[18]。到現在，研究者從菌體的發現和菌體的次生代謝產物到現在探究對海洋放射菌次生代謝產物對沉積物微生物的影響[19-20]。

本研究擬建立海洋放線菌Salinispora arenicola的接合轉移體系，探討通過該系統將外源脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段導入海洋放線菌Salinisporaarenicola的可能性，旨在為該菌的抗生素生物合成機制研究和生物學改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

海洋放線菌Salinispora arenicola、整合型質粒pIB139和pSET152、接合轉移供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）、基因克隆受體E.coli DH10B均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

卡那霉素、阿泊拉霉素、氯霉素、硫鏈絲菌素、硫鏈絲菌素、氨芐青霉素、限制性內切酶Lambda/Hind III、DNA回收試劑盒和質粒提取試劑盒：大連寶生物工程有限；黃豆餅粉甘露醇海鹽（soybeanflourmannitolsalt，SFMS）培養基：上海士鋒生物技術有限公司；LB營養瓊脂培養基和2×YT肉湯培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 培養基和抗生素

SFMS培養基用于海洋放線菌Salinispora arenicola的平板培養和接合轉移；LB培養基用于細菌的培養；2×YT肉湯培養基用于孢子的預萌發。LB培養基中抗生素終質量濃度為：氯霉素25μg/mL，阿泊拉霉素25μg/mL，氨芐青霉素100μg/mL，卡那霉素25μg/mL；接合轉移培養基抗生素使用終質量濃度為萘啶酮酸25μg/mL，阿泊拉霉素25μg/mL。

1.2 儀器與設備

LRH-150生化培養箱：上海印溪儀器儀表有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直送風超凈工作臺：上海康器設路儀備有限公司；T100型梯度聚合酶鏈式反應（polymerasechain reaction，PCR）儀、BYKT-Sub-cellGT型水平電泳槽：美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 抗生素敏感性實驗

融化已滅菌的SFMS培養基，將溫度降至45℃后，加入適當質量濃度的抗生素（氯霉素0～100μg/mL，卡那霉素0～100μg/mL，硫鏈絲菌素0～100μg/mL，阿泊拉霉素0～100 μg/mL），將Salinispora arenicola菌株孢子懸液涂布于SFMS培養基平板，并于28℃培養5 d，最終依據菌株生長狀態來評定該菌株對抗生素的敏感性。

1.3.2 質粒DNA的跨屬接合轉移

pSET152整合質粒大小為5.5 kbp，是由鏈霉菌噬菌體ΦC31發展而來的，包含了阿泊拉霉素的抗性基因[acc（3）IV]、完整的大腸桿菌pUC18的復制子、用于結合轉移的ori T以及噬菌體ΦC31的整合酶（int）和整合位點（attP）。質粒pIB139是鏈霉菌的表達質粒，啟動子和復制子分別為ermEp和pBR322 ori，質粒標簽為LacZα，具有安普霉素的原核抗性特性。通過CaCl2法將整合型質粒pIB139和pSET152導入接合轉移的大腸桿菌ET12567（pUZ8002）中，借助于pUZ8002上的tra基因，上述兩種質粒可以以接合轉移的方式從大腸桿菌進入Salinisporaarenicola細胞中，并發生整合。

1.3.3 接合轉移子的驗證

以質粒pIB139和pSET152上的阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV為模板，進行引物設計以驗證陽性接合轉移子，引物如下：

CP1：5'-TTTATCACCACCGACTATTTGC-3'；

CP2：5'-TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。

提取Salinisporaarenicola總DNA進行聚合酶鏈式反應（PCR）驗證。其反應程序為：98℃、1 min，98℃、30 s，58℃、30 s，72 ℃、30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 穩定性驗證

于不含抗生素的SFMS平板上接種接合子轉移子，28℃培養15 d，然后將菌體再次接種在不含抗生素的SFMS平板上，按照上述方法連續轉接3次進行分離純化，然后隨機挑選單菌落，并將其轉接到含有25μg/mL阿泊拉霉素的SFMS平板上，培養5 d后依據單菌落的生長狀態來確定質粒pIB139和pSET152在接合轉移子中的遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 海洋放線菌Salinispora arenicola抗生素敏感性檢測

為確定在進行遺傳操作時的可用選擇標記，分別測試了Salinispora arenicola菌株對幾種抗生素的敏感性，結果（表1）顯示，在含有阿泊拉霉素和卡那霉素含量≥25μg/mL的培養基平板上Salinisporaarenicola菌株不能生長，表明該菌株對于阿泊拉霉素和卡那霉素比較敏感；在含有50μg/mL氯霉素的培養基平板上Salinisporaarenicola菌株不能生長，說明該菌株對于氯霉素較為敏感；在含有100μg/mL硫鏈絲菌素的培養基平板上Salinispora arenicola菌株可以生長，說明該菌株對于硫鏈絲菌素不敏感。由于本研究所使用的接合轉移質粒上攜帶有阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV，因此綜合考慮，用25μg/mL阿泊拉霉素篩選接合轉移子。

表1 海洋放線菌S.arenicola在4種不同含量抗生素平板上的生長情況Table 1 Growth of the actinomycetes S.arenicola in media with four different concentrations of antibiotic tablets

2.2 Salinispora arenicola菌株與大腸桿菌之間兩親接合轉移

通過接合轉移法分別將質粒pIB139和pSET152從供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）中導入Salinispora arenicola菌株的孢子和新鮮菌絲體中，結果表明，當以孢子作為受體時，在接合轉移的實驗中，能夠獲得抗性菌落；當以新鮮菌絲體作為受體時，在接合轉移的實驗中，不能成功獲得抗性菌落；因此證明，該接合轉移系統中孢子是最佳受體。

2.3 受體菌和供體菌的比例

為確定該系統供體菌和受體菌最佳比例，將不同比例的Salinispora arenicola孢子和大腸桿菌進行混合涂布平板。結果（表2）表明，當大腸桿菌與孢子的比例為15∶1和8∶1時都能獲得數量較多的轉化子，且大腸桿菌與孢子的比例為8∶1時獲得的轉化子更多，說明在該比例體系中大腸桿菌數量的持續增加并不能繼續提高轉化效率，綜合考慮最終選擇大腸桿菌與孢子比例為8∶1。

表2 基于鏈霉菌孢子的接合轉移平板統計Table 2 Statistical analysis of conjugation and transfer based on streptomyspore

2.4 接合轉移子的驗證

以CP1和CP2為引物對獲得的接合轉移子進行PCR擴增驗證，以質粒pIB139和pSET152的擴增結果為陽性對照，以出發菌株Salinispora arenicola總DNA的擴增結果為陰性對照，擴增結果（圖1）顯示，2株接合轉移子都可成功擴增出目標882 bp條帶。分別回收2株接合轉移子的擴增條帶，進行TA克隆后送公司測序，測序結果表明，2株接合轉移子皆為陽性克隆。

圖1 pIB139和pSET152接合轉移子的PCR驗證Fig.1 PCR verification from pIB139 and pSET152 zygote

2.5 質粒pIB139和pSET152在Salinispora arenicola接合轉移子中的穩定性檢測

為進一步檢測整合型質粒pIB139和pSET152在Salin ispora arenicola接合轉移子中的穩定性，隨機挑取已驗證正確的300個接合轉移子進行培養，結果發現300個接合轉移子在無抗生素和添加有阿泊拉霉素的SFMS培養基平板上均能生長。結果表明，整合型質粒pIB139和pSET152在Salinispora arenicola接合轉移子中可穩定存在。

3 討論

向宿主細胞中導入外源DNA的方法有很多，包括顯微注射、接合轉移、電轉化和鈣轉化等。其中，接合轉移方法價格最低，而且導入效率較高，因此被廣泛應用于放線菌領域的研究。質粒是一種閉合環狀雙鏈DNA[21]，其游離于染色體DNA之外。在進行放線菌遺傳操作時常被作為載體用于介導向宿主細胞中導入外源DNA，可分為整合型載體和非整合型載體，如整合型質粒pIB139和pSET152[22-23]。而非整合型載體又可分為游離型載體和自殺型載體[24]，例如游離型載體pYH7[25-26]。在接合轉移過程中，含有外源載體的供體菌和受體菌在同一個平板上生長，兩者之間存在相互競爭。一般放線菌的生長速度大大慢于大腸桿菌，所以過量的大腸桿菌會大大抑制放線菌的正常生長，最終導致接合轉移率大大降低。因此，在建立遺傳操作系統時摸索受體菌和供體菌之間的最佳比例就顯得尤為重要。

4 結論

本研究通過對菌株Salinisporaarenicola抗生素敏感性測定和基于孢子和菌絲體接合轉移系統的摸索，成功地將整合型載體質粒pIB139和pSET152導入菌株Salinispora arenicola的染色體中，并通過PCR的方法證明了所獲得的接合轉移子的正確性，充分說明在本研究中建立的遺傳操作系統是有效可行的。

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