廣東客家黃酒中乳酸菌分離鑒定與菌株特性研究

錢 敏，湯斯斯，趙文紅*，莫依燦，蘇曉莉，李 斌

（1.仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.華南農業大學 食品學院，廣東 廣州 510642）

廣東客家黃酒是黃酒的一個重要分支，已有兩千多年的歷史，黃酒中細菌的種類眾多，有研究者利用基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorptiontimeof flight massspectrometry，MALDI-TOF）與指紋識別結合16SrRNA基因測序和種特異的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術鑒定出黃酒發酵中的細菌有芽孢桿菌（Bacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、明串珠菌屬（Ascococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、乳酸菌等[1]。其中，乳酸菌在黃酒發酵過程中起到了很大作用，與酵母共同發酵，對酒的口感與香氣起著決定性作用[2]，其來源主要是酒曲和黃酒在初發酵時從空氣接入[3-5]。在以往的廣東客家黃酒的微生物研究中，鮮有對乳酸菌的分離與鑒定，而乳酸菌與黃酒的發酵與品質有著重要的聯系，因此將乳酸菌分離鑒定，進行單獨研究有重要的意義。

近年來乳酸菌對外界的特性逐漸成為人們研究的熱點，乳酸菌的耐藥能力、耐乙醇能力等特性在醫學與食品領域被廣泛利用[6]。通過研究其特性，可以篩選出適用于釀造的菌種，對酒類發酵的影響研究也起到重要的鋪墊作用[7-9]。本研究結合黃酒的發酵條件，對黃酒酒曲與發酵酒醪中乳酸菌菌株進行分離純化，對其進行形態學、生理生化、分子生物學鑒定，并對其生長曲線，產酸能力，對鹽、pH、糖及乙醇的耐受性進行測定，以期為探究乳酸菌對黃酒發酵的影響提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米：散裝市售；米酒（酒精度為29.5%vol）：廣東省九江雙蒸酒；紅曲、麥曲、酒藥：廣東河源紫金某酒廠；071880乳桿菌生化鑒定盒、溴甲酚紫（bromocresol purple，BCP）培養基、MRS培養基：廣東環凱微生物科技有限公司；Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

GI54DW型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；B104光學生物顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司；電磁pHS-3CpH計：上海精密科學儀器有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱：寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

酒曲中乳酸菌分離：分別將1 g酒曲樣品（紅曲、麥曲、酒藥）磨成粉，溶于無菌生理鹽水中，進行梯度稀釋。吸取0.2 mL稀釋液涂布于BCP瓊脂平板培養基，放入裝有厭氧產氣劑的產氣袋中，將產氣袋置于35℃的恒溫培養箱中，培養48 h后，挑取單菌落進行劃線分離，反復對每次培養完成后的菌落進行簡單染色并鏡檢，判斷其純度。分離出純的菌株后，劃線于MRS斜面培養基上，置于35℃培養箱擴大培養48 h，進行生理生化鑒定實驗，將初步確定為乳酸菌的菌株劃線接種于MRS斜面培養基上，35℃培養48 h，保存于4℃冰箱中[10-11]。

酒醪中乳酸菌分離：取5 g酒醪置于無菌生理鹽水中攪拌得到樣品液，以酒曲中乳酸菌分離方法進行純化[12-14]。

1.3.2 乳酸菌的鑒定

采用菌落形態觀察、生理生化特性試驗以及分子生物學鑒定方法相結合[15-16]：對菌株進行革蘭氏染色，觀察其形態；接入微型生化鑒定管進行菌屬鑒定[17]；利用Ezup柱式細菌基因組抽提試劑盒進行基因組的提取，提取后的DNA送至上海美吉生物醫藥科技有限公司廣州分公司進行DNA測序，通過菌株序列16SrDNA序列對比分析及利用Mega6.0制作系統發育樹[18]。

1.3.3 乳酸菌的菌株特性

（1）生長曲線的測定

將2 McFarland濃度菌懸液按照2%（V/V）的接種比例，將菌懸液接入到24支裝有MRS液體培養基中的試管中，35℃條件下靜置培養，每隔2 h取出一支測菌液OD600nm值。以無菌MRS肉湯培養基作為空白實驗組，在波長600 nm條件下進行OD600nm值測定，讓菌液的測定結果值在0.10～0.65的范圍內，若結果值是稀釋后所得，則必須要乘以稀釋倍數才是菌液的實際OD600nm值。

（2）產酸能力測定

將2 McFarland的菌懸液，按1%（V/V）接種于MRS肉湯培養基中，35℃厭氧條件下培養48 h。每隔6 h測定培養基pH[19-20]。

（3）pH對乳酸菌生長特性的影響

用1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH調節MRS液體培養基，使其pH分別為2、4、6、8、10、12。將2 McFarland的菌懸液，按1%（V/V）接種于上述培養基中，35℃厭氧條件下培養15～20 h后，取上述處理菌液，于波長600 nm處測定OD600nm值[21-23]，考察pH對乳酸菌生長特性的影響。

（4）糖含量對乳酸菌生長特性的影響

參照文獻[24]中黃酒釀造過程中的總糖實驗數據，用葡萄糖將MRS肉湯培養基的糖含量調節為30～240 g/L，以30 g/L為梯度制成8個濃度液體培養基，將2 McFarland的菌懸液，按1%（V/V）接種于上述培養基中，35℃厭氧條件下培養15～20 h后，取上述處理菌液，于波長600 nm處測定OD600nm值[25]，考察糖含量對乳酸菌生長特性的影響。

（5）乙醇含量對乳酸菌生長特性的影響

參照文獻中黃酒釀造過程中酒精度的變化數據[26]，將MRS肉湯培養基的酒精度調節為6%vol～30%vol，以6%為梯度制成5個濃度液體培養基，按1%（V/V）的接種量接種于上述培養基中，35℃厭氧條件下培養15～20h后，取上述處理菌液，分光光度計在波長600 nm處測定OD600nm值[27]，考察乙醇含量對乳酸菌生長特性的影響。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

2.1.1 乳酸菌的分離與純化

經過分離與純化，得到兩株乳酸菌A、E，菌株在BCP瓊脂培養基上生長的菌落形態如圖1所示，MRS瓊脂培養基的菌落形態如圖2所示，鏡檢結果如圖3所示。

由圖1可知，在BCP瓊脂培養基上，菌株A與E均可生長，且都可使溴甲酚紫由紫色變為黃色，其中菌株E更容易使溴甲酚紫變色，可初步判定兩株菌為乳酸菌。兩者單個菌落微小，皆＜0.5 mm，呈圓形，單個菌落呈現淡黃色，濕潤，中央凸起，邊緣整齊，表面光滑有光澤，而菌株A菌落比E菌落稍大。

由圖2可知，在MRS瓊脂培養基上，菌株A與E長勢很好，兩者單個菌落較在BCP培養基上生長要大，這與MRS培養基里的充足營養有關系，菌落大小在0.5～3.0mm之間，為圓形，單個菌落呈現乳白色，濕潤，中間有凸起，邊緣整齊，表面光滑有光澤，且菌株A菌落比E菌落大。

圖1 菌株A和E在BCP瓊脂培養基上的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of strain A and E on BCP agar medium

圖2 菌株A和E在MRS瓊脂培養基上的菌落特征Fig.2 Colony characteristics of strain A and E on MRS agar medium

圖3 菌株A和E的革蘭氏染色結果Fig.3 Results of strain A and E by Gram stain

由圖3可知，菌株A與E皆為革蘭氏陽性菌，個體微小，桿狀直線型菌，無鞭毛，無芽孢。菌株A多以兩個菌體排列，菌株E則多為單個菌體存在，菌株A個體明顯比菌株E大。

2.1.2 乳酸菌的生化鑒定

生化鑒定反應結果如表1所示。由表1可知，菌株A8種生化反應結果均為陽性，菌株E僅山梨醇反應為陰性，參考乳桿菌生化鑒定盒使用說明可判斷菌株A與E為乳酸桿菌屬（Lactobacillus）。

表1 菌株A和E的生理生化鑒定結果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain A and E

2.1.3 乳酸菌的16SrDNA序列對比分析結果

將序列利用NCBI中的BLAST方法與GenBank中數據庫中的序列比較，比較得到相似性為99%～100%的16SrDNA序列，從中隨機選取100%的序列利用MEGA 6.0中的鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）構建系統發育樹，重復1 000次，樹為無樹根[28]。系統發育樹見圖4。

菌株A命名為Hakka yellow rice wine A，由圖4a可知，菌株A與植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）的相似率為100%，因此可以判斷菌株A為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖4 菌株A(a)和菌株E(b)系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain A(a)and strain E(b)

菌株E命名為Hakkayellow ricewine E，由圖4b可知，菌株E與戊糖乳桿菌（Lactobacilluspentosus）的相似率為100%，因此可以判斷菌株E為戊糖乳桿菌（Lactobacilluspentosus）。

2.2 乳酸菌的菌株特性

2.2.1 生長曲線測定

經檢測，菌株A與E生長48 h后的菌株生長曲線如圖5所示。

圖5 菌株A和E的生長曲線Fig.5 Growth curves of strain A and E

由圖5可知，發現兩者的生長情況幾乎相同，但菌株E的生長比菌株A略微緩慢。2～6h時，菌株A和E生長緩慢，該時段為延緩期；在6～16 h，OD600nm值快速上升，可知此時菌株在快速生長繁殖，該時段為對數期；16～20 h時的OD600nm值上升緩慢，在20 h后幾乎無變化，進入穩定期[29-30]。

2.2.2 產酸能力檢測結果

菌株A和E在48 h內的產酸能力如圖6所示。

圖6 菌株A和E的產酸能力與培養時間的關系Fig.6 Relationship between acid-producing ability and culture time of strain A and E

由圖6可知，菌株A與E的產酸能力相當，兩種菌的pH在0～6 h時幾乎無變化，在6～12 h時開始極速下降，該時段菌株處于對數期，菌株快速繁殖，故開始大量代謝酸性物質；12～24 h時酸度呈緩慢下降趨勢，在24 h后酸度基本保持穩定，菌株A的pH為3.8左右，菌株E pH保持在3.6左右，這與菌株處于穩定期有一定關系。

2.2.3 pH對乳酸菌生長特性的影響

不同pH對菌株的生長情況如圖7所示。

圖7 不同p H對菌株A和E生長的影響Fig.7 Effects of different pH on the growth of strain A and E

由圖7可知，兩菌株在不同酸度的影響下，其生長趨勢幾乎相同，都是先隨著pH的增加而穩步上升，達到1.9左右后保持平穩，當pH超過某個堿性值后，菌株的生長受到抑制而呈現下降趨勢。其中，在pH為2～6區間里，菌株A與菌株E的生長隨著酸度的減弱而不斷增強，當pH6～8時的A菌OD600nm值最高，為1.969，當pH超過8后，其OD600nm值為0.475，說明當pH＞8，會嚴重阻礙菌株A的生長；菌株E在pH6～10時，OD600nm值1.9左右，在pH10～12時，OD600nm值接近為1左右，說明菌株E在pH＞10后，生長受到抑制。結果表明，菌株A和E的最適生長pH為4～6。

2.2.4 糖含量對乳酸菌生長特性的影響

不同糖含量對菌株A和E的耐受力影響結果見圖8。

圖8 不同糖含量對菌株A和E生長的影響Fig.8 Effects of different sugar concentrations on the growth of strain A and E

由圖8可知，A菌和E菌的OD600nm值隨著糖含量的增加呈現下降的趨勢，尤其當糖含量＞90 g/L之后，菌株A和E OD600nm值迅速下降。因此，當糖含量＞90 g/L，菌株A和E的生長會受到一定的抑制。

2.2.5 乙醇含量對乳酸菌生長特性的影響

不同乙醇含量對菌株A和E的的影響，結果見圖9。

圖9 不同乙醇含量對菌株A和E生長的影響Fig.9 Effects of different ethanol contents on the growth of strain A and E

由圖9可知，在乙醇含量為6%時，菌株E的OD600nm值為0.430，明顯高于菌株A；隨著乙醇含量的增加，菌株E的OD600nm值下降，當乙醇含量為30%時，OD600nm值為0.352；菌株A的起始OD600nm值為0.328，在乙醇含量為6%～18%，其OD600nm值下降速率較菌株E大，在乙醇含量18%～30%時，保持平穩在0.182左右，表明乙醇含量為18%時，對菌株A的抑制作用已達極限。因此，菌株A和E在乙醇含量＞6%之后，便受到抑制，并且菌株A較菌株E更為敏感。

3 結論

本研究對廣東客家黃酒酒曲與發酵酒醪中的乳酸菌進行分離純化得到菌株A和E，對這兩株菌進行形態學、生理生化、分子生物學鑒定，確定這兩株菌分別為植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）和戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）。本研究還對它們的生長曲線，產酸能力，對鹽、pH、糖及乙醇含量的耐受性進行測定。兩菌株生長曲線測定結果說明，在35℃條件下，培養2～6 h為菌株生長的延緩期，6～16 h為對數期，20 h后完全進入穩定期。產酸實驗說明兩菌株的產酸能力都很強；菌株A和E的最適生長pH值為4～6；當糖含量＞90 g/L，兩菌株的生長受到抑制；菌株A和E在乙醇含量＞6%之后便受到抑制，并且菌株A較菌株E菌更為敏感。

乳酸菌是對黃酒發酵過程起重要作用的微生物，它的存在有利于黃酒風味的形成與發酵環境的穩定。目前對客家黃酒中乳酸菌的研究尚淺，特別是乳酸菌的種屬確定、自身的代謝等都有待進一步探索，以期為黃酒品質的改善提供更多的理論依據。

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