低場核磁共振技術測定石花菜對酸奶水分遷移及超微結構的影響

林圣楠，李天驕，田永奇，陳雅霜，李夢嬌，朱 豐，林向陽*

（福州大學 生物科學與工程學院，福建 福州 350108）

水分是酸奶的重要成分，水分的存在狀態對于酸奶產品質量的好壞起到了重要的作用。酸奶發酵和儲藏過程其實就是水與蛋白質大分子和鈣等物質相互作用的過程，這一過程涉及水分存在狀態的變化、水分的分布與遷移、水分與蛋白質的結合與解析等[1-3]。近年來，國內外對于低場核磁共振技術（nuclear magnetic resonance，NMR）測定奶制品的報道不絕于耳，但對石花菜酸奶中水分遷移特性及微結構的研究罕見報道。萬婕[4]采用核磁共振技術研究發酵及儲藏過程中酸奶的水分變化。結果表明，經高壓處理的膳食纖維酸奶持水性更強，乳清不易析出。王兆龍[5]將核磁共振技術應用在抗性淀粉酸牛奶中，結果表明，酸奶pH值與結合較緊密的水分子質子密度線性相關。HINRICHSR等[6]利用核磁共振考察酸奶凝膠體系。LUCAST等[7]利用核磁共振評價配方中乳化劑的性質、蛋白質對脂肪的影響并通過測量橫向弛豫時間和縱向弛豫時間來研究液態和冷凍條件下的冰淇淋，此方法論證了在冷凍狀態下核磁共振依然可以測定氫質子的結合狀態。BOTLAN D L等[8]通過對比示差掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）和低場核磁共振及其核磁成像技術（magnetic resonance imaging，MRI）測量乳脂肪固相脂肪指數比發現，NMR比DSC造成的誤差更低。DEAN RL等[9]將差示掃描量熱法與核磁共振結合，考察奶中氫質子分布結合情況，結果表明，兩種方法相結合使不同的水-蛋白質的反應的區分更明顯。

利用核磁共振技術在食品研究上的優勢，研究石花菜酸奶的弛豫參數，從而分析對比其與酸奶在發酵及儲藏過程中的水分狀態、水分遷移及水分分布具有重大意義。本實驗利用低場核磁共振及其成像技術對比了石花菜酸奶發酵及冷藏后熟過程的水分遷移特性，從分子角度闡述了添加石花菜對酸奶水分遷移的影響；并采用環境掃描電鏡對石花菜酸奶和酸奶的超微形貌特征進行觀察分析，從微觀角度分析了影響酸奶結構及持水特性的因素。本試驗采用低場核磁共振技術測定石花菜酸奶加工以及儲藏過程中弛豫時間和質子密度的變化，結合核磁共振成像（MRI）獲得酸奶在各過程中高清晰度圖像，并采用環境掃描電鏡（environment scanning electron microscope，ESEM）對石花菜酸奶超微形貌特征進行觀察分析，以確定酸奶最佳發酵時間及冷藏后熟時間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石花菜：青島海悠悠商貿有限公司；高蛋白脫脂高鈣奶粉：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；白砂糖（食品級）：廈門古龍食品有限公司；HOWARU乳雙歧桿菌HN019：杜邦丹尼斯克公司；厭氧產氣袋、圓底立式培養袋、氧氣指示劑：青島雅各化學試劑銷售有限公司。

1.2 儀器與設備

CJM-SC-A型高能納米沖擊磨：秦皇島太極環納米制品有限公司；MINIMR核磁共振分析儀（23 MHz，0.56 T）：上海紐邁電子科技有限公司；FM200實驗室高剪切分散乳化機：上海弗魯克流體機械制造有限公司；KQ-300VDE型三頻數控超聲波清洗器；昆山市超聲儀器有限公司；BC/BD-217CH冷柜：河南新飛電器有限公司；BS110S電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；VF-12型廣州匯利醒發箱：佛山市南海港洋機電設備有限公司；XL30 ESEM-TMP型環境掃描電鏡：荷蘭Philips-FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 石花菜酸奶的制備

石花菜的前處理：將干凈的石花菜經高能納米沖擊磨粉碎得到石花菜粉末，然后在石花菜粉中加入蒸餾水，在90℃、80 kHz條件下超聲120 min，充分浸提出石花菜中的營養成分，并趁熱抽濾得石花菜瓊膠溶液[10]。

以蔗糖添加量11%、石花菜瓊膠溶液添加量20%、雙歧桿菌接種量1.5%，于高蛋白脫脂高鈣奶粉配制的濃度為12.5%的復原乳中，并置于45℃恒溫培養箱中發酵，4℃條件培養冷藏后熟24 h[10]。利用核磁共振技術分別測定發酵0、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h時石花菜酸奶中的水分遷移行為。

1.3.2 酸奶的制備

以蔗糖添加量11%、雙歧桿菌接種量1.5%于高蛋白脫脂高鈣奶粉配制的濃度為12.5%的復原乳中，并置于45℃恒溫培養箱中發酵，4℃條件培養冷藏后熟24 h。利用核磁共振技術分別測定發酵0、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h、48 h時酸奶中的水分遷移行為。

1.3.3 核磁共振試驗及其參數設定

稱取約2.500 g樣品放入玻璃試管（口徑18 mm），而后將樣品管置于NMR探頭中（保持溫度32℃），使用CPMG序列測試橫向弛豫時間T2，其中接收機帶寬是SW=200 kHz，采樣起始點控制參數RFD=0.080 ms，重復采樣時間間隔TW=4 000.000 ms，模擬增益RG1=20.0 db，90°和180°脈寬分別是P90=20.00μs，P180=39.00μs，采樣點數TD=207 830，數字增益DRG1=3，數據半徑DR=1，累加掃描次數NS=8，回波個數NECH=5 000。試驗測3份平行。

反演所得的圖譜獲得弛豫時間T2和質子密度M2。弛豫時間T2表征水分流動性大小，當弛豫時間T2越大，水流動性越大，水分結合越松，質子密度M2表征弛豫時間下水分的含量[11-14]。

1.3.4 低場核磁共振測定核磁共振成像試驗及參數設定

采用多層自旋回波序列（multi-slice echo，MSE）進行質子加權成像，Y軸為選層梯度，X軸為相位梯度，Z軸為讀出梯度，90°和180°軟脈沖均為1 200μs，重復采樣時間D0為1 000.000 ms，半回波時間D4為0.100 ms，選層梯度脈沖（90°）對應的補償梯度GA1為13.5%，選層梯度脈沖（180°）對應的補償梯度脈沖GA2為80.0%，相位編碼脈沖的幅度GA3為35.0%，頻率編碼方向的補償梯度脈沖的幅度GA4為57.0%，頻率編碼脈沖的幅度GA5為30.0%[11-14]。

1.3.5 環境掃描電鏡試驗及參數設定

取一定量酸奶、石花菜酸奶樣品置于-18℃冷柜中預凍7 h，后置于-80℃超低溫冰箱中冷凍4 h，取出后立即凍干24 h。再將凍干后的樣品噴金，抽真空后在15.0 V加速電壓下進行掃描電鏡測試[15]。

1.3.6 樣品數據分析

實驗采用Excel軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 石花菜酸奶核磁共振分析

本課題利用核磁共振儀對酸奶及石花菜酸奶發酵及貨架期的自旋-自旋弛豫時間進行測定，結果見圖1。由圖1可知，軟件擬合后得到2個峰。酸奶橫向弛豫時間范圍T21（57.223 68～75.646 33 ms）較小，質子密度M21也較小，說明T21水分子可能是形成網絡結構孔隙中所束縛的不易流動的水，氫鍵結合力度較強，也可能是與蛋白質等大分子結合較緊密的那部分水，橫向弛豫時間范圍T22（200.923 3～464.158 88 ms）比T21高，且質子密度M22也較高，說明T22水分子結合較為疏松，流動性較高[16-20]。由峰比例可以看出，T21與T22的峰比例為0.015 39∶0.984 6，T21結果不顯著（P＞0.05），因此，以研究T22峰面積變化為主。以T22及該組分水對應的質子密度M22為主要指標，結合質子密度成像結果和環境掃描電鏡成像分析酸奶發酵凝乳結構的變化，對石花菜酸奶和酸奶水分遷移特性進行比較。

圖1 石花菜酸奶橫向弛豫時間分布Fig.1 Transverse relaxation time distribution of Gelidium amansii yoghurt

2.2 不同發酵時間石花菜酸奶及酸奶的核磁共振數據變化

酸奶發酵后水分子與蛋白質分子交聯形成凝膠空間網絡結構。發酵及貯藏時間是決定酸奶品質的關鍵因素，時間過短，乳酸產生較少，pH尚未降低到等電點，酪蛋白未能完全解離與疏水鍵、氫鍵和靜電斥力等形成三維凝膠網狀結構，造成酸奶膠黏性降低，未能形成凝乳結構。而發酵時間過長，菌利用營養物質后產生代謝產物累積，造成酸環境紊亂，凝膠結構被破壞，酸奶分層，乳清析出。所以，探索酸奶最適發酵時間具有重要意義，不同發酵及貯藏時間酸奶的橫向馳豫時間結果見圖2。由圖2可知，兩種酸奶橫向弛豫時間T22總體都是先增加后減少。這可能是因為發酵過程使得酸奶體系組分遷移，水分流動性增加。奶中的酪蛋白膠束解離后利用疏水鍵、氫鍵和靜電斥力等形成三維凝膠網絡，因此水分子在水與水之間的快速交換含蛋白質和游離水，酸奶體系組分遷移，促使之前與蛋白質等大分子結合較緊密的組分獲得一定流動性[11-14]。當酸奶冷藏后期，弛豫時間降低，主要是因為形成凝乳網絡，大部分自由水被束縛在凝膠網絡微孔中，水分流動性減小，持水性增強。

圖2 酸奶發酵時間對橫向弛豫時間T22的影響Fig.2 Effect of yogurt fermentation time on transverse relaxation time T22

由圖2可知，石花菜酸奶在0～6 h前橫向弛豫時間總體大于不添加石花菜發酵的酸奶，而6～48 h時，石花菜酸奶的橫向弛豫時間反而小于酸奶，24 h趨于穩定。發酵初始，由于添加了石花菜瓊膠熱溶液與復原乳混合，水分流動性增加，而在發酵過程中，水分子與瓊脂中的疏水主鏈通過氫鍵結合，石花菜瓊膠溶液從雙螺旋結構逐漸形成三維網狀的凝膠結構，形成瓊脂聚合物。蛋白質酪蛋白膠束與瓊膠分子間相互纏結形成網絡節點，三維網狀凝膠結構結合更加緊密，因此添加石花菜瓊膠的酸奶具有較高的持水能力，體系水分流動性較低。貯藏階段，酸奶的橫向弛豫時間略微增大，主要是由于分子間氫鍵斷裂，同時凝乳的結構被破壞導致與大分子結合的水分游離出來，乳清析出，流動性變強，這同時也說明了添加石花菜瓊膠有利于酸奶的持水性和穩定性[11-14]。因此，發酵6 h時達到最佳狀態，此時橫向弛豫時間最大。24 h時石花菜酸奶橫向弛豫趨于穩定，將發酵24 h的石花菜酸奶取出用于后續實驗。

為進一步分析在不同發酵時間條件下酸奶持水能力的變化，以T22組分的質子密度M22作為對象進行研究，結果見圖3。

圖3 不同酸奶發酵時間對質子密度M22的影響Fig.3 Effect of different yogurt fermentation time on proton density M22

由圖3可知，隨著發酵時間的延長，質子密度M22逐漸下降，說明持水性增加。這可能是因為酸奶在發酵過程中，牛乳中的酪蛋白形成三維凝膠網絡，流動性較大的水分子束縛在網絡結構的孔隙中，降低了水分流動性，增加持水性。而酸奶質子密度M22在48 h時略微增加，可能是因為酸奶體系中形成的蛋白質膠體結構被破壞，乳清析出，造成體系水分流失[11]。

由圖3還可看出，添加石花菜瓊膠發酵的酸奶水分含量逐漸高于不添加石花菜瓊膠的酸奶，這是因為石花菜瓊膠與牛乳酪蛋白的相互作用，石花菜瓊膠通過雙螺旋結構的羥基與相鄰的螺旋或水分子進行氫鍵結合，凝膠三維網絡結構更為緊密。流動性較大的水分子被包裹在三維網狀凝膠結構內部，內部的氫鍵束縛住更多自由水，增強穩定性，提高持水性，降低流動性。

2.3 石花菜酸奶及酸奶核磁共振成像結果

石花菜酸奶和酸奶在發酵24 h時的MRI質子密度成像結果見圖4，質子密度越大則圖像越亮，代表此部分水分分布越多。由圖4可知，石花菜酸奶樣品成像區域亮度比酸奶亮，即含水量比酸奶多，持水性更好。由MRI結果直觀地監測到水分分布狀態，石花菜酸奶較亮，水分含量較多，說明加入了石花菜瓊膠使得水分被凝膠結構所包圍，使得水分不游離出來。而酸奶樣品周圍較暗，說明水分分布從酸奶表面流失，乳清析出，分子間氫鍵斷裂，凝乳的結構被破壞，與大分子結合的水分部分游離出來，圖像亮度較暗[21]。

圖4 石花菜酸奶（a）及酸奶（b）的質子密度成像結果Fig.4 Results of proton density images of Gelidium amansii yogurt(a)and yogurt(b)

2.4 環境掃描電鏡成像結果

實驗對石花菜瓊膠、發酵24 h的酸奶、石花菜酸奶取樣并在環境掃描電鏡進行測試，觀察酸奶的微觀結構，酸奶、石花菜瓊膠、石花菜酸奶的微觀結構見圖5。由圖5可知，將石花菜瓊膠添加到高蛋白低脂高鈣復原乳中發酵的酸奶，凝膠過程中，蛋白質酪蛋白膠束與瓊膠分子間相互纏結，蛋白鏈球顆粒粘結在致密的瓊膠網絡結構之中交聯形成網狀結構。電鏡成像結果與弛豫特性測定結果相一致，添加石花菜瓊膠發酵，瓊膠結構致密，與蛋白鏈球充分粘結在一起形成一個整體，蛋白顆粒交聯形成網絡結構，此階段為石花菜酸奶發酵完成階段[22]。

圖5 環境掃描電鏡成像結果（×10 000）Fig.5 Results of environment scanning electron microscope images(×10 000)

3 結論

利用低場核磁共振儀中CPMG序列測定石花菜酸奶及酸奶的橫向弛豫時間T2，經軟件擬合后共得到兩個組分的峰，它們代表酸奶中流動性不同的水分，分別為結合較為緊密的水T21（57.223 68～75.646 33 ms）和流動性較大的水T22（200.9233～464.15888ms）。以質子密度M22為主要指標，結合成像結果，研究酸奶在發酵及儲藏過程中的水分遷移及水分狀態變化，發現石花菜酸奶的水分含量變化幅度小于酸奶，說明了添加石花菜瓊膠的酸奶持水性更強。確定了最優發酵時間為6h，后熟時間為24h。通過環境掃描電鏡技術分析發現添加石花菜瓊膠發酵的酸奶，其蛋白質酪蛋白膠束與瓊膠分子間相互纏結，蛋白鏈球顆粒粘結在致密的瓊膠網絡結構之中，持水性提高，與核磁共振分析結果一致。

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