SLC12A5和Ki-67在結直腸癌中的表達及臨床意義

王曉元，趙軼峰，楊永江，武雪亮，李 坤，李曙光

盡管近年來結直腸癌的普查力度不斷加強、手術方式不斷改進、靶向藥物的大力推廣，并取得了一系列的突破，但其術后5年生存率仍不到50%[1]，因而深入探尋結直腸癌的分子機制和特異性強的標志物，對于早期診斷、臨床治療、術后監測有著極其重要的價值。

SLC12A5是近年來發現的一種新型致癌基因，該基因能顯著增強細胞增殖和促進G1-S期轉化，抑制腫瘤細胞凋亡[2]。目前僅在膀胱移行細胞癌中顯示SLC12A5呈高表達狀態，SLC12A5在癲癇等一些神經功能疾病中發揮重要作用[3-4]，而在結直腸癌方面的研究鮮有報道。Ki-67是目前應用較廣的腫瘤增殖性抗原，其表達指數常用于評估惡性腫瘤細胞的增殖活性[5]。該研究通過免疫組化法檢測SLC12A5和Ki-67表達在結直腸癌中的表達情況，探討其相互關系及與相關臨床病理因素間的相關性，為結直腸癌的診斷、靶向治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1病例資料收集2016年9月～2017年1月河北北方學院附屬第一醫院胃腸腫瘤外科手術切除的結直腸癌組織40例、結直腸腺瘤30例和正常結直腸組織40例，癌組織取自癌灶中心處，另取標本殘端切緣經病理證實為正常腸組織。全部病例為原發性腫瘤，且術前未行新輔助放化療等針對性治療，術后標本均在1 h內獲得，并存于液氮中。其中結直腸癌組織中男25例，女15例, 年齡32～70(50.5±14.6)歲；腺瘤組織中，男19例，女11例,年齡30～66(51.3±11.8)歲，正常結直腸組織中, 男22例，女18例,年齡31～68(51.6±11.5)歲，3組一般資料具有可比性。

1.2主要試劑與實驗方法

1.2.1主要試劑 兔抗人單克隆濃縮型SLC12A5抗體、鼠抗人Ki-67單克隆抗體購自香港Abcam公司；DAB顯色劑購自上海Gene Tech公司。

1.2.2免疫組織化學染色 10%甲醛溶液固定標本，石蠟包埋，切片4 μm，蘇木精-伊紅染色，病理診斷。切片經80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脫水，滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復；PBS洗3次，加一抗(1 ∶100)50 μl，4 ℃過夜；PBS洗3次，加二抗50 μl。室溫下DAB顯色，PBS洗3次，蘇木精輕度復染，鹽酸乙醇分化，流水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，松節油透明，樹膠封片，陰性對照為PBS代替一抗，光鏡下觀察。

1.2.3陽性結果判定標準 SLC12A5陽性染色主要集中于細胞質中，少量表達于細胞核，Ki-67陽性染色主要集中于細胞核，均為棕黃色或褐色顆粒，計算陽性細胞百分比并評分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%時為2分，51%～75%時為3分，>75%時為4分；無著色:0分，淺黃色:1分，黃色:2分，深黃色:3分。兩者相乘，0分為(-) ,1～4分為(+) ,5～8分為(),9～12分為(),(+)～()均視為陽性。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計數資料以百分率表示，運用χ2檢驗分析SLC12A5和Ki-67的表達與臨床病理參數之間的關系，相關性分析采用Pearson法，設α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1結直腸癌、腺瘤、正常組織中SLC12A5和Ki-67表達情況癌組、腺瘤組和正常組織中SLC12A5陽性表達率組間差異有統計學意義(P<0.05)；癌組、腺瘤組和正常組織中Ki-67陽性表達率組間差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1和表1、2。

2.2SLC12A5和Ki-67表達與結直腸癌臨床病理特征的關系SLC12A5和Ki-67的表達均與腫瘤的浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移及脈管浸潤相關(P<0.05)。TNM分期高、伴淋巴結轉移、肝轉移和脈管浸潤的患者SLC12A5和Ki-67的表達均增強，而SLC12A5和Ki-67的陽性表達與患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度等均無相關性,見表3。

2.3SLC12A5和Ki-67在結直腸癌中表達的相互關系SLC12A5和Ki-67在結直腸癌中的表達呈正相關性(r=0.518,P=0.000)。SLC12A5在Ki-67陽性組中的表達(陽性率82.05%)明顯高于在Ki-67陰性組中的表達(陽性率36.36%)，差異有統計學意義(P<0.001)，見表4。

圖1 結直腸正常組織、腺瘤和癌組織中SLC12A5、Ki-67蛋白的表達 SP×200

組別nSLC12A5(n)-+陽性率(%)χ2值P值癌4056111887．5016．3860．000腺瘤301665346．677．957?#0．008正常402773332．504．525?0．032

與癌組比較：*P<0.05;與正常組比較：#P<0.05

表2 Ki-67在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的表達

與癌組比較：*P<0.05;與正常組比較：#P<0.05

表3 SLC12A5、Ki-67在結直腸癌組織中的表達及與臨床病理因素的關系

表4 SLC12A5、Ki-67在結直腸癌組織中表達的相關性(n)

3 討論

SLC12A5是溶質載體家族12亞組中的重要成員之一，定位于人染色體20q13.12，這是人類多種惡性腫瘤最常見的擴增區[6]。SLC12A5最初是作為一種跨膜氯化鉀轉運體被發現的，這種轉運體可以維持神經元內外氯平衡，因而最初對SLC12A5的研究僅局限于癲癇、精神分裂癥、情感障礙等神經系統疾病[7-8]。而近年來研究[9]顯示SLC12A5突變或異常表達參與某些實體瘤的發生發展。研究[10]表明，SLC12A5抗凋亡的作用是通過抑制凋亡誘導因子和核酸內切酶G-依賴的凋亡信號通路介導的，而促轉移作用是通過調節基質體系結構的關鍵要素，包括各類基質金屬蛋白酶(MMPs)和纖維連接蛋白(FN類)等。

Ki-67是目前應用最廣泛的細胞增殖標志物之一，與多種腫瘤的發展、浸潤、轉移及預后有關,其在細胞周期的G1、Gs、G2和M期均有表達，是全面準確評估增殖活性的客觀指標[11-12]。

本研究通過免疫組化法檢測顯示SLC12A5在結直腸癌組織中的陽性表達率明顯高于正常組織，表明SLC12A5過表達在結直腸癌癌變過程中發揮促進作用，SLC12A5是一種促進結直腸癌發生和發展的致癌基因。結直腸癌伴漿膜浸潤者較未侵及漿膜者SLC12A5蛋白表達明顯增高；伴肝轉移、淋巴結轉移、脈管浸潤者較無轉移浸潤者SLC12A5蛋白表達明顯增高；TNM分期越高，SLC12A5蛋白表達也越高，表明SLC12A5蛋白表達水平與結直腸腫瘤的惡性生物學行為密切相關，對結直腸癌的侵襲、轉移有促進作用。Yu et al[13]通過單細胞測序研究發現突變型SLC12A5在大腸癌患者中呈高表達，而在正常人群中呈低表達，因而表明突變型SLC12A5在大腸癌中有潛在的致癌作用。進一步研究顯示SLC12A5的過表達與大腸癌患者生存期顯著下降關系密切。Xu et al[14]通過基因測序、基因擴增技術發現SLC12A5與原發性大腸癌的發生密切相關，其能顯著促進細胞增殖，誘導細胞周期G1過渡，增強其侵襲、遷移能力。Liu et al[15]通過實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測癌細胞系、Western blot法和免疫組織化學法檢測SLC12A5在膀胱腫瘤中的表達，發現SLC12A5可能作為調節NF-κB信號通路，促進膀胱腫瘤轉移。此外，本研究顯示SLC12A5和Ki-67二者在結直腸癌中呈明顯正相關性，二者在結直腸癌的發生、進展過程中具有協同作用，但具體機制目前尚不明確。

總之，SLC12A5的異常高表達參與結直腸癌的發生、演進，其誘導Ki-67的過表達可能是促進其浸潤、轉移的重要途徑之一，對二者作用機制的深入探討將有望為結直腸癌精準化治療提供科學依據。

[1] Jemal A,SiegeI R,Wand E, et al.Cancer Statistics 2008[J]. CA Cancer J Clin，2008,58(2):71-96.

[2] Tao R,Li C,Newburn E N,et al.Transcript-specific associations of SLC12A5 (KCC2) in human prefrontal cortex with development,schizophrenia,and affective disorders[J].J Neurosci,2012,32(15):5216-22.

[3] Saito T,Ishii A,Sugai K,et al.A de novo missense mutation in SLC12A5 found in a compound heterozygote patient with epilepsy of infancy with migrating focal seizures[J].Clin Genet,2017,11(5):2241-52.

[4] Kursan S,McMillen T S,Beesetty P,et al.The neuronal K+Cl-co-transporter 2 (Slc12a5) modulates insulin secretion[J].Sci Rep,2017,7(1):1732-40.

[5] Sobecki M,Mrouj K,Camasses A,et al.The cell proliferation antigen Ki-67 organises heterochromatin[J].Elife,2016,5:e13722.

[6] Doshina A,Gourgue F,Onizuka M,et al.Cortical cells reveal APP as a new player in the regulation of GABAergic neurotransmission[J].Sci Rep,2017,7(1):370-81.

[7] Tang X,Kim J,Zhou L,et al.KCC2 rescues functional deficits in human neurons derived from patients with Rett syndrome[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2016,113(3):751-6.

[8] Saitsu H,Watanabe M,Akita T,et al.Impaired neuronal KCC2 function by biallelic SLC12A5 mutations in migrating focal seizures and severe developmental delay[J].Sci Rep,2016,6(11):30072-81.

[9] Burrell R A,McGranahan N,Bartek J,et al.The causes and consequences of genetic heterogeneity in cancer evolution[J].Nature,2013,501(9):338-45.

[10] Merner N D,Chandler M R,Bourassa C,et al.Regulatory domain or CpG site variation in SLC12A5,encoding the chloride transporter KCC2, in human autism and schizophrenia[J].Front Cell Neurosci,2015,9(15):386-95.

[11] Yin H,Sheng Z,Zhang X,et al.Overexpression of SOX18 promotes prostate cancer progressionviathe regulation of TCF1,c-Myc,cyclin D1 and Ki-67[J].Oncol Rep,2017,37(2):1045-51.

[12] 汪 潔,劉 斌,李 莉,等.孤立性纖維性腫瘤影像學表現及與Ki-67表達的相關性[J].安徽醫科大學學報,2017,52(5):777-89.

[13] Yu C,Yu J,Yao, X,et al.Discovery of biclonal origin and a novel oncogene SLC12A5 in colon cancer by single-cell sequencing[J].Cell Res,2014,24(6):701-12.

[14] Xu L X,Li X X,Cai M Y,et al.Increased expression of Solute carrier family 12 member 5viagene amplification contributes to tumour progression and metastasis and associates with poor survival in colorectal cancer[J].Gut,2016,65(4):635-46.

[15] Liu J Y,Dai Y B,Li X,et al.Solute carrier family 12 member 5 promotes tumor invasion/metastasis of bladder urothelial carcinoma by enhancing NF-kappaB/Ki-67 signaling pathway[J].Cell Death Dis,2017,8(3):e2691.