潰瘍性結腸炎血小板中鉀通道和NLRP3表達的臨床意義

葉盛林，梅詠玉，韓 瑋，楊 青，胡 翠，劉曉昌，梅 俏，許建明

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)中腸道炎癥與止血機制密切相關[1]，可能與血小板的功能改變有關，血小板不僅參與止血過程，還可分泌炎癥因子(如IL-1β)，參與炎癥過程[2]。IBD患者的顯著特征包括血小板功能活化，如GPIIb/IIIa、P-選擇蛋白和CD40L表達增加，其中潰瘍性結腸炎( ulcerative colitis, UC)患者血小板作為重要的炎癥細胞也有明顯的功能活化[3]。研究[2]顯示血小板參與炎癥反應需要IL-1β信號和NLRP3炎性小體活化，靜息狀態血小板可表達NLRP3、接頭分子，在活化狀態血小板中兩者共定位組裝成功能性NLRP3炎癥小體，激活procaspase-1形成caspase-1，產生IL-1β等炎癥因子，促進炎癥過程。

NLRP3是核苷酸結合寡聚域樣受體家族分子中的一種胞內型受體，與接頭分子及效應分子(caspase-1)組裝成NLRP3炎癥小體。NLRP3炎癥小體的激活需要NF-κB介導炎癥小體前體表達上調，招募接頭分子組裝成特定結構，活化pro-caspase-1，產生炎癥因子IL-1β和IL-18。在炎癥性疾病(如自身免疫性疾病、感染、敗血癥)中均有NLRP3炎癥小體的參與[4]。鉀和鈣是激活NLRP3炎癥小體的關鍵介質[5]。Kv1.3通道是血小板的主要電壓門控鉀通道，Kv1.3通道促進活化血小板的早期鈣離子內流，胞漿內鈣離子濃度明顯增加，Kv1.3通道可能通過增加激動劑誘發的Ca2+流入影響血小板活化[6]。血小板中存在中電導的鈣激活的鉀通道(Kca3.1)，可能與Kv1.3一起協同調節血小板內外鉀和鈣濃度，影響NLRP3炎癥小體和血小板的活化過程[6-7]。因此，該研究通過檢測活動期UC血小板Kca3.1、Kv1.3和NLRP3的表達情況，探討潰瘍性結腸炎血小板中NLRP3表達與鉀通道的關系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1病例資料收集安徽醫科大學第一附屬醫院明確診斷的UC患者17例，年齡19～64(38.71±14.12)歲，采用改良Mayo評分標準進行疾病活動性評分，17例UC均為活動期，其中輕度3例，中度9例，重度5例。按2012年我國炎癥性腸病診斷共識意見(廣州)作為UC診斷標準[8]。正常對照組為經體檢均合格及近3個月無胃腸道癥狀的11例健康志愿者，年齡24～55(35.00±9.86)歲，兩組年齡差異無統計學意義。

1.2標本采集收集患者入院后(24 h內)次日晨的5 ml全血，立即低速離心(1 300 r/min，15 min)獲取富血小板血漿(PRP)，取出PRP再次離心(3 000 r/min，20 min)去除血漿后，獲取血小板于-80 ℃保存。

1.3RT-PCR方法檢測血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的mRNA表達將血小板解凍，加入TRIzol(美國Invitrogen公司)勻漿裂解，再依次以氯仿、異丙醇、75℅乙醇(DEPC水配制)抽提，獲取干燥RNA沉淀后，加入DEPC水溶解得總RNA。按逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)，總RNA被逆轉錄為cDNA 。GAPDH作為內參，按試劑盒說明書(德國Qiagen公司)的步驟進行加樣擴增獲取RT-PCR產物，引物序列和產物長度，反應條件均為97 ℃、5 min，93 ℃、30 s，52 ℃、30 s，70 ℃、40 s，36個循環；70 ℃、10 min，4 ℃、10 min。紫外凝膠成像系統分析各樣本中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的表達情況。見表1。

表1 RT-PCR引物序列和產物長度

1.4Westernblot方法檢測血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的蛋白表達取血小板解凍，裂解(RIPA細胞裂解液)后，離心取上清液，按照1 ∶4加入的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min后上樣(每孔15 μl)，電泳，300 mA恒流轉膜，完成后洗去轉膜液加Western封閉液(5%脫脂奶粉)封閉2 h。參考一抗及二抗說明書，按照合適的比例滴加一抗稀釋液(Kca3.1抗體屬性為兔抗1 ∶200 稀釋；Kv1.3抗體屬性為鼠抗1 ∶500稀釋；NLRP3抗體屬性為兔抗1 ∶200稀釋)，4 ℃緩慢搖動孵育過夜。加入洗滌液(PBST)洗滌3次，每次洗滌10 min，按照相應比例加辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗稀釋液。室溫孵育2 h。加入洗滌液(PBST)洗滌8 h，洗滌3次。最后用ECL發光試劑盒(美國Thermo公司)進行蛋白檢測。

2 結果

2.1UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3mRNA表達水平的改變與正常對照組相比，UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3 mRNA表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 RT-PCR法檢測 Kca3.1、Kv1.3和NLRP3在正常和UC血小板中的表達

2.2UC患者血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3mRNA表達與疾病嚴重程度的關聯分析輕、中、重度三組UC患者，Kca3.1 、Kv1.3、NLRP3 mRNA表達均高于正常對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。組間比較差異均無統計學意義。見表2。

表2 不同嚴重程度UC血小板中Kca3.1、Kv1.3和NLRP3 mRNA的相對表達

2.3UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表達水平的改變與正常對照組比較，UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.4UC患者血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表達與疾病嚴重程度的關聯分析輕、中、重度三組UC患者中血小板Kca3.1、Kv1.3及NLRP3蛋白表達進行比較，差異無統計學意義；提示血小板Kca3.1、Kv1.3及NLRP3 蛋白表達水平與疾病的嚴重程度無明顯相關性。

圖2 Western blot法檢測 Kca3.1、Kv1.3和NLRP3在正常和UC血小板中的表達

2.5UC患者血小板中NLRP3蛋白與Kca3.1、Kv1.3蛋白表達水平的相關分析相關分析顯示，Kca3.1與NLRP3的蛋白表達水平明顯相關，差異有統計學意義(r=0.877，P<0.01)(圖3)；Kv1.3與NLRP3的蛋白表達水平有一定的相關趨勢，差異無統計學意義。UC患者血小板Kca3.1、Kv1.3與NLRP3 蛋白表達水平分別與紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate ，ESR)、C反應蛋白(C-reactive protein ，CRP)、Mayo評分進行相關性分析，均無明顯相關性，差異無統計學意義(表3)。

圖3 NLRP3和Kca3.1在蛋白質水平的相關性分析

3 討論

UC以反復發作的慢性非特異性腸道炎癥為特征，發病機制尚不十分清楚。研究[3-4]顯示，血小板炎癥反應參與了UC的病理生理過程，在小鼠DSS結腸炎模型中發現活化血小板數量明顯增加[9]。血小板作為重要的炎癥細胞在適應性免疫應答中具有關鍵作用，活化的血小板可以通過多種機制介導炎癥和免疫應答，包括釋放促炎、抗炎及血管生成因子，募集炎細胞到血管損傷和炎癥部位[10]。研究[2]顯示受登革熱病毒感染患者體內血小板被激活及NLRP3-caspase-1炎癥小體組裝并介導血小板微粒中的IL-1β分泌，刺激血管內皮，導致通透性增加，加重滲出及炎癥反應，IL-1β信號傳導及NLRP3炎性小體活化參與血小板炎癥過程。NLRP3基因與UC的易感性相關，可能在UC發病過程中起重要作用。研究[11]顯示NLRP3炎癥小體在DSS結腸炎模型結腸組織中高表達，槐耳提取液通過降低結NLRP3及IL-1β表達，改善結腸炎癥。NLRP3是NLRP3炎癥小體的關鍵組成部分，是NLRP3炎性小體激活的限速步驟[12]。因此，根據研究結果推測血小板中NLRP3的表達改變所致的炎癥損傷可能與UC的發生過程有關。

表3 UC患者血小板蛋白質表達水平與ESR、CRP和Mayo評分的相關性分析

血小板中主要存在Kv和Kca兩種類型鉀通道，分別以Kv1.3和Kca3.1為主[6-7,13]。Mahaut-Smith[7]研究發現血小板存在Ca2+依賴性K+通道(Kca通道)。使用膜片鉗技術證實血小板中存在高密度電壓門控K+通道(Kv通道)和Kca通道[6-7]。研究[6,14]顯示血小板Kv1.3通道與血小板活化有關，Kca3.1可能參與此過程，鉀離子通過鉀通道外流所致的細胞內低鉀是導致NLRP3炎癥小體活化重要條件，抑制鉀離子外流可抑制NLRP3炎癥小體的活化。相關研究[15]顯示K+外排可能是所有NLRP3刺激致NLRP3激活所必需的共同特征。因此，UC中血小板Kv1.3、Kca3.1鉀通道與NLRP3炎癥小體的表達是否改變目前尚不清楚。

本研究顯示， UC血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的mRNA和蛋白表達明顯增高，提示血小板中Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的過表達可能參與UC的病理生理過程；而Kca3.1、Kv1.3及NLRP3的表達水平與UC的嚴重程度以及CRP、ESR及Mayo評分等均無明顯相關性，進一步提示以上三種物質的表達可能與病情嚴重程度及活動性無關。研究[3,6,14]顯示，UC中血小板明顯活化，血小板活化與鉀通道和NLRP3炎癥小體活化有關，推測UC血小板中Kca3.1、Kv1.3可能引起胞液內鉀和鈣離子濃度改變，進一步改變NLRP3活化過程，促進血小板活化，參與UC的炎癥過程。另一方面，NLRP3與Kca3.1、Kv1.3蛋白表達水平有一定相關，提示UC血小板中NLRP3過表達與血小板中的鉀通道增多可能有關。因此，推測由于感染等誘因，引起UC血小板中Kca3.1和Kv1.3鉀通道明顯增多及血小板內外鉀鈣離子濃度改變，促進NLRP3表達及NLRP3炎癥小體活化，促進血小板活化，釋放炎癥因子，促進UC腸道炎癥的發生，但UC血小板活化的具體機制仍需進一步研究。

[1] Danese S, Papa A, Saibeni S, et al. Inflammation and coagulation in inflammatory bowel disease: the clot thickens[J]. American J Gastroentero, 2007, 102(1): 174-86.

[2] Hottz E D, Lopes J F, Freitas C, et al. Platelets mediate increased endothelium permeability in dengue through NLRP3-inflammasome activation[J]. Blood, 2013, 122(20): 3405-14.

[3] Collins C E, Cahill M R, Newland A C, et al. Platelets circulate in an activated state in inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 1994, 106 (4): 840-5.

[4] Wirnsberger G, Zwolanek F, Asaoka T, et al. Inhibition of CBLB protects from lethal candida albicans sepsis[J]. Nat Med, 2016, 22(8): 915-23.

[5] Man S M, Kanneganti T D. Regulation of inflammasome activation[J]. Im munol Rev, 2015, 265(1): 6-21.

[6] McCloskey C, Jones S, Amisten S, et al. Kv1.3 is the exclusive voltage-gated K+channel of platelets and megakaryocytes: roles in membrane potential, Ca2+signalling and platelet count[J]. J Physiol, 2010, 588(9): 1399-406.

[7] Mahaut-Smith M P. Calcium-activated potassium channels in human platelets[J]. J Physiol, 1995, 484(1): 15-24.

[8] 胡品津. 炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年·廣州)解讀[J]. 胃腸病學, 2012, 17(12): 709-11.

[9] Yan S L , Russell J, Harris N R, et al. Platelet abnormalities during colonic inflammation[J]. Inflamm Bowel Dis, 2013, 19(6): 1245-53.

[10] Vieira-de-Abreu A, Campbell R A, Weyrich A S, et al. Platelets: versatile effector cells in hemostasis, inflammation, and the immune continuum[C]. Semin Immunopathol, 2012, 34(1): 5-30.

[11] Wang L, Yu Z, Wei C, et al. Huaier aqueous extract protects against dextran sulfate sodium-induced experimental colitis in mice by inhibiting NLRP3 inflammasome activation[J]. Oncotarget, 2017, 8(20): 32937-45.

[12] Latz E, Xiao T S, Stutz A. Activation and regulation of the inflammasomes[J]. Nat Rev Immunol, 2013, 13(6): 397-411.

[13] Mahaut-Smith M P, Rink T J, Collins S C, et al. Voltage-gated potassium channels and the control of membrane potential in human platelets[J]. J Physiol, 1990, 428: 723-35.

[14] Pétrilli V, Papin S, Dostert C, et al. Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration[J]. Cell Death Differ, 2007, 14(9): 1583-9．