FAM96B在胃癌組織中的表達及其對胃癌細胞增殖凋亡和侵襲轉移的影響

葉家欣，王世杰，馬丹丹，蔡 遜，張智勇，張建新，田 俊

胃癌的形成和轉移涉及到癌基因的激活、抑癌基因的失活及由此引起的各種細胞生物學行為的改變[1-2]。96序列相似的家庭成員B (family with sequence similarity 96, member B, FAM96B)是分子量為18×103的小分子蛋白，其生物學功能尚不明確[3]。目前研究[4-5]顯示，FAM96B作為潛在抑癌基因參與腫瘤的發生發展、侵襲轉移及血管形成。FAM96B在人肝癌、結腸癌組織中低表達，成為癌癥潛在的診斷和治療靶點[6-9]。但是FAM96B在胃癌發生發展中的功能尚未見報道。該研究旨在觀察FAM96B在80例胃癌組織中的表達水平，分析其表達差異與臨床病理特征的關系，并探討其對胃癌細胞系SGC7901細胞增殖、凋亡及侵襲轉移的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集中國人民解放軍武漢總醫院普通外科2015年7月～2016年7月的80例人胃癌組織及配對癌旁組織標本，均置入液氮中保存備用。

1.2主要試劑質粒提取試劑盒及總蛋白抽提試劑盒購自北京Tiangen公司； DMEM培養液、胎牛血清、胰酶及MTT均購自日本Sigma公司；FAM96B及β-actin單克隆抗體均購自英國Abcam公司；RNA提取、逆轉錄試劑盒及細胞轉染試劑盒均購自美國Invitrogen公司；細胞凋亡及周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；人胃癌細胞系SGC7901與pcDNA3.1-myc-FAM96B質粒保存于本院中心實驗室。

1.3Westernblot檢測FAM96B蛋白表達全蛋白提取液提取蛋白，Bradford法蛋白定量。SDS-PAGE電泳分離。PVDF膜轉移蛋白電化學發光法顯影檢測。

1.4MTT法檢測SGC7901細胞活性取對數生長期的SGC7901細胞接種于96孔板,每孔約100 μl，24 h后轉染，分為FAM96B組和對照組。DMEM培養基培養1～4 d，每孔加MTT和DMSO溶液，酶標儀檢測各孔吸光度值，繪制細胞生長曲線。

1.5流式細胞儀檢測SGC7901細胞凋亡將細胞收集后，按照說明書加5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻，用流式細胞儀檢測異硫氰基熒光素,利用CellQuest軟件獲取并分析細胞凋亡率。

2 結果

2.1Westernblot檢測結果FAM96B蛋白在80例新鮮癌旁組織和胃癌組織中的表達量分別為(1.71±0.29)vs(0.28±0.08)，差異有統計學意義(t=25.218，P<0.05)。FAM96B蛋白在癌旁組織中的表達顯著高于胃癌組織。見圖1。

2.2FAM96B蛋白表達水平與胃癌臨床病理特征之間的關系FAM96B蛋白在胃癌組織中的表達量以胃癌組織FAM96B條帶的灰度值與對應的β-actin的灰度值之比來表示。通過統計分析得：FAM96B蛋白表達量與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期顯著相關(P<0.05)，然而與性別、年齡、腫瘤大小無明顯相關。見表1。

圖1 Western blot檢測FAM96B在胃癌及癌旁組織中的蛋白表達

N：癌旁組織；T：胃癌組織；1：泳道1；2：泳道2;與癌旁組織比較：*P<0.05

表1 FAM96B蛋白表達量與胃癌臨床病理特征之間的關系

2.3MTT法檢測SGC7901細胞活性FAM96B組吸光度顯著低于對照組(P<0.05)，即過表達FAM96B可抑制SGC7901細胞增殖，見圖2。

2.4流式細胞儀檢測SGC7901細胞凋亡率過表達FAM96B組的細胞凋亡率顯著高于對照組[(38.46±1.14)%vs(3.70±0.65)%，t=85.585，P<0.05]，即過表達FAM96B可誘導SGC7901細胞凋亡。見圖3。

圖2 SGC7901細胞生長曲線與對照組比較：*P<0.05

A：對照組；B：FAM96B組；Q1：機械性損傷；Q2：晚期凋亡或壞死細胞；Q3：正常細胞；Q4：早期凋亡細胞

3 討論

胃癌是常見惡性腫瘤之一，5年相對生存率不足20%。因此探討胃癌發生發展、侵襲轉移的病理生理機制對于胃癌的防治具有重要的現實意義。越來越多的證據顯示：FAM96B可能在血管內皮細胞增殖、侵襲轉移中扮演重要角色，并參與細胞有絲分裂和凋亡，且與某些腫瘤的發生發展密切相關[10-11]。但FAM96B與胃癌發生發展、侵襲轉移的關系國內外未見報道。

在腫瘤組織及其相應鄰近正常組織中異常表達的基因可認為是潛在的控制細胞增殖和凋亡的癌基因和抑癌基因。本研究中Western blot檢測結果證實FAM96B在胃癌組織中的蛋白表達顯著低于癌旁組織。可見, FAM96B在具有抑癌基因特性，在胃癌發生發展過程中扮演重要角色。與張智勇 等[6]、蔡遜 等[7-9]的研究結果相一致。

腫瘤侵襲轉移是導致癌癥患者死亡的主要原因之一，腫瘤細胞離開原發灶并侵入周圍組織和(或)侵襲血管與淋巴管進入循環系統向遠處組織擴散形成新的轉移灶，在血供充分的情況下增殖形成轉移瘤。本研究通過對FAM96B蛋白表達與胃癌臨床病理特征之間關系的分析，得出FAM96B在胃癌組織中表達下降與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期顯著相關。提示FAM96B可能是一個與胃癌浸潤及轉移相關的分子指標，在胃癌發展、浸潤及轉移中起到一定的抑制作用。

目前，基因克隆、基因轉染是明確基因功能的主要方法。為進一步研究FAM96B在胃癌發生發展中的功能，本研究將FAM96B質粒通過脂質體轉染法轉染至SGC7901細胞中，觀察FAM96B基因過表達對胃癌細胞生物學功能的影響。本研究中，MTT實驗結果提示過表達FAM96B可抑制胃癌細胞系SGC7901增殖。Ito et al[3]報道FAM96B定位于紡錘體，在染色體正常分離中發揮作用，FAM96B沉默導致結腸癌細胞系HCT-116細胞不能正常有絲分裂，致使異型細胞核堆積。染色體反復獲得、缺失或錯誤分離率增加可引起異常的有絲分裂，多核細胞產生，進而導致細胞凋亡[12]。上述國外研究[3]有力地證實FAM96B與細胞凋亡密切相關。本研究中，流式細胞儀檢測結果顯示過表達FAM96B可顯著誘導SGC7901細胞凋亡，與國外文獻報道基本一致。

本研究結果證實：FAM96B作為抑癌基因能夠抑制胃癌發生發展及侵襲轉移，并誘導胃癌細胞凋亡。可能成為胃癌診斷和治療的潛在靶點之一。

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