異煙肼和利福平聯(lián)用致小鼠肝損傷實驗?zāi)Ｐ偷慕?/h1>
2011-08-07 02:22:16楊淑艷鐘秀宏趙麗微吉林醫(yī)藥學(xué)院吉林市132013
中國藥房 2011年33期
楊淑艷，鐘秀宏，王 爽，溫 娜，趙麗微（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林市 132013）
結(jié)核病又稱癆病，近年來，在農(nóng)村發(fā)病有上升的趨勢。臨床應(yīng)用的抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平和利福霉素鈉等均對肝有損害作用，是藥物肝毒性臨床監(jiān)測的重點藥物[1]。由于抗結(jié)核藥物致肝損傷的病程在臨床實踐中難以觀察，因此有必要建立抗結(jié)核藥物致肝損傷的動物模型。目前國內(nèi)外均已有關(guān)于抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)肝損傷動物模型的報道，但所用的實驗方法和劑量各不相同，多選用大鼠[2，3]作為動物模型。本研究選用小鼠作為動物模型，因為小鼠也可用于各種藥物的急、慢性毒理實驗，且價格低廉，通過動態(tài)觀察小鼠肝功能及其組織病理學(xué)變化，了解抗結(jié)核藥物聯(lián)用致小鼠肝損傷的程度，可為抗結(jié)核藥物的預(yù)防研究提供有價值的動物模型。
1 儀器與材料
1.1 儀器
BA300型數(shù)碼生物顯微鏡（中國麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；ZMN-7803型全自動組織包埋機（常州市華利電子有限公司）；SelectraXL型全自動生化分析儀（荷蘭威圖儀器有限公司）；TD5A型臺式低速離心機（湖南凱達科學(xué)儀器有限公司）；AG135電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；772可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）。
1.2 試藥
異煙肼片（山西太原藥業(yè)有限公司，批號：090101，規(guī)格：每片50 mg）；利福平膠囊（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1001131，規(guī)格：每粒0.15 g）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（濰坊三維生物工程集團有限公司，批號：100401）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和考馬斯亮藍測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20100428）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.3 動物
昆明種小鼠32只，♀♂各半，體重22～24 g，吉林大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（吉）2008-0005。
2 方法
2.1 藥物的制備
取異煙肼和利福平直接溶于生理鹽水中，各自制成濃度為0.75%的灌胃液。
2.2 建模
取小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（生理鹽水）和模型組（異煙肼+利福平，均為75 mg·kg－1·d－1），各16只，異煙肼和利福平選取劑量為人臨床用劑量體重?fù)Q算的5.5倍[3]，每日空腹灌胃給予相應(yīng)藥物1次，灌胃體積為20 mL·kg－1·d－1。實驗第7天，隨機處死對照組和模型組各8只小鼠，其余小鼠繼續(xù)灌胃至實驗第14天。末次灌胃后禁食不禁水16 h，摘眼球取血，剖腹取肝。
2.3 觀察指標(biāo)
2.3.1 血清生化指標(biāo)。全自動生化分析儀檢測各組小鼠實驗第7、14天血清中ALT和AST活性。
2.3.2 肝病理學(xué)檢查。取肝用10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡觀察第7、14天小鼠肝病理組織學(xué)變化。
2.3.3 肝組織中MDA含量與SOD活性。取肝組織，制成勻漿，按試劑盒說明書檢測第7、14天小鼠肝組織中MDA含量與SOD活性變化。
2.4 統(tǒng)計學(xué)處理
3 結(jié)果
3.1 血清中ALT和AST活性變化
與對照組比較，模型組小鼠第7、14天血清中ALT、AST活性明顯增強（P＜0.05或P＜0.01）。與第7天比較，模型組小鼠第14天血清中AST活性明顯增強（P＜0.05），結(jié)果見表1。
表1 不同時間各組小鼠ALT、AST活性比較（±s，n＝8）Tab 1 Comparison of the activities of ALT and AST between two groups at different tim（e±s，n＝8）
表1 不同時間各組小鼠ALT、AST活性比較（±s，n＝8）Tab 1 Comparison of the activities of ALT and AST between two groups at different tim（e±s，n＝8）
與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第7天比較：#P＜0.05vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the 7th day：#P＜0.05
組別對照組模型組第7天ALT/U·L－1 39.63±9.40 126.50±43.61＊＊AST/U·L－1 171.63±36.89 232.13±34.98＊第14天ALT/U·L－1 40.13±8.31 171.63±101.86＊＊AST/U·L－1 190.88±42.97 316.88±105.71＊#
3.2 肝病理學(xué)變化
光鏡可見對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列整齊，僅個別小鼠肝細胞可見空泡變性；模型組第7天處死的小鼠肝細胞索排列較紊亂，肝細胞體積增大，胞質(zhì)疏松，可見程度不等的細胞水腫，有少量的肝細胞壞死和炎細胞浸潤；模型組第14天處死的小鼠肝細胞索排列紊亂，肝細胞發(fā)生壞死較嚴(yán)重，并伴有明顯的炎細胞浸潤，具體見圖1。
圖1 各組小鼠肝病理學(xué)變化光鏡圖（HE，×100）Fig 1 Hepatic pathology of mice in the different groups under the light microscop（eHE，×100）
3.3 肝組織中SOD和MDA活性變化
與對照組比較，模型組小鼠第14天肝組織中MDA含量明顯增加，SOD活性明顯降低（P＜0.01），結(jié)果見表2。
表2 各組小鼠肝組織中MDA、SOD活性比較（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of MDA content and SOD activity in liver between two group（s±s，n＝8）
表2 各組小鼠肝組織中MDA、SOD活性比較（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of MDA content and SOD activity in liver between two group（s±s，n＝8）
與對照組比較：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01
組別對照組模型組第14天MDA/nmol·mg－1pro 0.91±0.19 1.12±0.11＊SOD/U·mg－1pro 118.27±9.41 92.56±9.10＊
4 討論
肝損傷動物模型的誘導(dǎo)是進行防治肝損傷藥物研究的前提。目前，有關(guān)急性肝損傷動物模型的誘導(dǎo)方法很多，主要有生物性、免疫性、化學(xué)性等方法。生物性方法要求實驗條件高且費用昂貴，限制了其應(yīng)用。免疫性方法是通過免疫方法造成肝損傷，主要用于通過免疫機制而抗肝損傷的藥物研究?；瘜W(xué)性方法則是通過化學(xué)性肝毒物質(zhì)，如四氯化碳、氨基半乳糖、硫代乙酰胺、異煙肼等致肝損傷。應(yīng)用四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷動物模型，條件要求低，技術(shù)易于掌握，可靠性強，重復(fù)性好，目前研究抗肝損傷新藥常采用四氯化碳誘導(dǎo)動物模型，但由于肝功能復(fù)雜和肝損害因素的多樣性，任何一種實驗?zāi)Ｐ投疾荒苋妗?zhǔn)確地反映特定肝損傷的本質(zhì)[4，5]。因此，建立特定有針對性的肝損傷動物模型非常必要。
異煙肼和利福平是臨床上常用的一線抗結(jié)核藥物，2藥聯(lián)用是目前結(jié)核病短程療法的治療方式，但其聯(lián)用肝毒性明顯增加[6]。為了減輕2藥聯(lián)用的毒副作用及為臨床研究作參考，有必要有針對性地建立2藥聯(lián)用致肝損傷的動物模型。目前2藥單用和聯(lián)用致大鼠肝損傷模型較多，但由于各種動物對藥物的敏感性不同，因此本研究采用異煙肼和利福平聯(lián)用建立小鼠肝損傷模型，劑量均為75 mg·kg－1·d－1，造模時間14 d，通過觀察和檢測不同時間對肝損傷形態(tài)和功能的影響來研究肝損傷的程度。結(jié)果顯示，異煙肼與利福平聯(lián)用隨時間的延長小鼠肝損傷加重。說明2藥聯(lián)用14 d后可成功建立肝損傷小鼠模型，成功率為100%，其機制可能與毒性代謝產(chǎn)物引起肝細胞脂質(zhì)過氧化有關(guān)[7]，因此該模型建立方法可用于抗結(jié)核藥物聯(lián)用致小鼠肝損傷的防治研究。
[1] 王新華，何紅梅，張延霞，等.黃芩苷對異煙肼和利福霉素鈉肝損傷小鼠的保護作用研究[J].中國藥房，2007，18（28）：2 175.
[2] Zha YF，Zhang GY，Li ZH，et al.Relevance research of artituberculosis on hepatic injury[J].Int J Respir，2006，26（10）：781.
[3] 楊慧媛，宋育林，許建明，等.異煙肼利福平合用致大鼠肝損傷的實驗?zāi)Ｐ蚚J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，43（2）：185.
[4] 齊艷萍，李和平.急性肝損傷動物模型制備的概述[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2008，38（2）：37.
[5] 王福根，孫靜霞.肝損傷動物模型的建立和應(yīng)用[J].中國藥房，2006，17（9）：702.
[6] Yue J，Peng RX，Yang J，et al.CYP2E1 mediated isoniazid-induced hepatotoxicity in rats[J].Acta Pharmacol Sin，2004，25（5）：699.
[7] 楊淑艷，鐘秀宏，沈 楠，等.抗癆藥所致肝損傷的發(fā)生機制和防治研究進展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2010，31（3）：159.
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1 儀器與材料
1.1 儀器
BA300型數(shù)碼生物顯微鏡（中國麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；ZMN-7803型全自動組織包埋機（常州市華利電子有限公司）；SelectraXL型全自動生化分析儀（荷蘭威圖儀器有限公司）；TD5A型臺式低速離心機（湖南凱達科學(xué)儀器有限公司）；AG135電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；772可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）。
1.2 試藥
異煙肼片（山西太原藥業(yè)有限公司，批號：090101，規(guī)格：每片50 mg）；利福平膠囊（沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1001131，規(guī)格：每粒0.15 g）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒（濰坊三維生物工程集團有限公司，批號：100401）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和考馬斯亮藍測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20100428）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
1.3 動物
昆明種小鼠32只，♀♂各半，體重22～24 g，吉林大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（吉）2008-0005。
2 方法
2.1 藥物的制備
取異煙肼和利福平直接溶于生理鹽水中，各自制成濃度為0.75%的灌胃液。
2.2 建模
取小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照組（生理鹽水）和模型組（異煙肼+利福平，均為75 mg·kg－1·d－1），各16只，異煙肼和利福平選取劑量為人臨床用劑量體重?fù)Q算的5.5倍[3]，每日空腹灌胃給予相應(yīng)藥物1次，灌胃體積為20 mL·kg－1·d－1。實驗第7天，隨機處死對照組和模型組各8只小鼠，其余小鼠繼續(xù)灌胃至實驗第14天。末次灌胃后禁食不禁水16 h，摘眼球取血，剖腹取肝。
2.3 觀察指標(biāo)
2.3.1 血清生化指標(biāo)。全自動生化分析儀檢測各組小鼠實驗第7、14天血清中ALT和AST活性。
2.3.2 肝病理學(xué)檢查。取肝用10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色。光鏡觀察第7、14天小鼠肝病理組織學(xué)變化。
2.3.3 肝組織中MDA含量與SOD活性。取肝組織，制成勻漿，按試劑盒說明書檢測第7、14天小鼠肝組織中MDA含量與SOD活性變化。
2.4 統(tǒng)計學(xué)處理
3 結(jié)果
3.1 血清中ALT和AST活性變化
與對照組比較，模型組小鼠第7、14天血清中ALT、AST活性明顯增強（P＜0.05或P＜0.01）。與第7天比較，模型組小鼠第14天血清中AST活性明顯增強（P＜0.05），結(jié)果見表1。
表1 不同時間各組小鼠ALT、AST活性比較（±s，n＝8）Tab 1 Comparison of the activities of ALT and AST between two groups at different tim（e±s，n＝8）
表1 不同時間各組小鼠ALT、AST活性比較（±s，n＝8）Tab 1 Comparison of the activities of ALT and AST between two groups at different tim（e±s，n＝8）
與對照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與第7天比較：#P＜0.05vs.control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the 7th day：#P＜0.05
組別對照組模型組第7天ALT/U·L－1 39.63±9.40 126.50±43.61＊＊AST/U·L－1 171.63±36.89 232.13±34.98＊第14天ALT/U·L－1 40.13±8.31 171.63±101.86＊＊AST/U·L－1 190.88±42.97 316.88±105.71＊#
3.2 肝病理學(xué)變化
光鏡可見對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞索排列整齊，僅個別小鼠肝細胞可見空泡變性；模型組第7天處死的小鼠肝細胞索排列較紊亂，肝細胞體積增大，胞質(zhì)疏松，可見程度不等的細胞水腫，有少量的肝細胞壞死和炎細胞浸潤；模型組第14天處死的小鼠肝細胞索排列紊亂，肝細胞發(fā)生壞死較嚴(yán)重，并伴有明顯的炎細胞浸潤，具體見圖1。
圖1 各組小鼠肝病理學(xué)變化光鏡圖（HE，×100）Fig 1 Hepatic pathology of mice in the different groups under the light microscop（eHE，×100）
3.3 肝組織中SOD和MDA活性變化
與對照組比較，模型組小鼠第14天肝組織中MDA含量明顯增加，SOD活性明顯降低（P＜0.01），結(jié)果見表2。
表2 各組小鼠肝組織中MDA、SOD活性比較（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of MDA content and SOD activity in liver between two group（s±s，n＝8）
表2 各組小鼠肝組織中MDA、SOD活性比較（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of MDA content and SOD activity in liver between two group（s±s，n＝8）
與對照組比較：＊P＜0.01vs.control group：＊P＜0.01
組別對照組模型組第14天MDA/nmol·mg－1pro 0.91±0.19 1.12±0.11＊SOD/U·mg－1pro 118.27±9.41 92.56±9.10＊
4 討論
肝損傷動物模型的誘導(dǎo)是進行防治肝損傷藥物研究的前提。目前，有關(guān)急性肝損傷動物模型的誘導(dǎo)方法很多，主要有生物性、免疫性、化學(xué)性等方法。生物性方法要求實驗條件高且費用昂貴，限制了其應(yīng)用。免疫性方法是通過免疫方法造成肝損傷，主要用于通過免疫機制而抗肝損傷的藥物研究?；瘜W(xué)性方法則是通過化學(xué)性肝毒物質(zhì)，如四氯化碳、氨基半乳糖、硫代乙酰胺、異煙肼等致肝損傷。應(yīng)用四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷動物模型，條件要求低，技術(shù)易于掌握，可靠性強，重復(fù)性好，目前研究抗肝損傷新藥常采用四氯化碳誘導(dǎo)動物模型，但由于肝功能復(fù)雜和肝損害因素的多樣性，任何一種實驗?zāi)Ｐ投疾荒苋妗?zhǔn)確地反映特定肝損傷的本質(zhì)[4，5]。因此，建立特定有針對性的肝損傷動物模型非常必要。
異煙肼和利福平是臨床上常用的一線抗結(jié)核藥物，2藥聯(lián)用是目前結(jié)核病短程療法的治療方式，但其聯(lián)用肝毒性明顯增加[6]。為了減輕2藥聯(lián)用的毒副作用及為臨床研究作參考，有必要有針對性地建立2藥聯(lián)用致肝損傷的動物模型。目前2藥單用和聯(lián)用致大鼠肝損傷模型較多，但由于各種動物對藥物的敏感性不同，因此本研究采用異煙肼和利福平聯(lián)用建立小鼠肝損傷模型，劑量均為75 mg·kg－1·d－1，造模時間14 d，通過觀察和檢測不同時間對肝損傷形態(tài)和功能的影響來研究肝損傷的程度。結(jié)果顯示，異煙肼與利福平聯(lián)用隨時間的延長小鼠肝損傷加重。說明2藥聯(lián)用14 d后可成功建立肝損傷小鼠模型，成功率為100%，其機制可能與毒性代謝產(chǎn)物引起肝細胞脂質(zhì)過氧化有關(guān)[7]，因此該模型建立方法可用于抗結(jié)核藥物聯(lián)用致小鼠肝損傷的防治研究。
[1] 王新華，何紅梅，張延霞，等.黃芩苷對異煙肼和利福霉素鈉肝損傷小鼠的保護作用研究[J].中國藥房，2007，18（28）：2 175.
[2] Zha YF，Zhang GY，Li ZH，et al.Relevance research of artituberculosis on hepatic injury[J].Int J Respir，2006，26（10）：781.
[3] 楊慧媛，宋育林，許建明，等.異煙肼利福平合用致大鼠肝損傷的實驗?zāi)Ｐ蚚J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，43（2）：185.
[4] 齊艷萍，李和平.急性肝損傷動物模型制備的概述[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2008，38（2）：37.
[5] 王福根，孫靜霞.肝損傷動物模型的建立和應(yīng)用[J].中國藥房，2006，17（9）：702.
[6] Yue J，Peng RX，Yang J，et al.CYP2E1 mediated isoniazid-induced hepatotoxicity in rats[J].Acta Pharmacol Sin，2004，25（5）：699.
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