QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蔬果中34 種植物生長調節劑的殘留量

郝 杰，姜 潔,*，毛 婷，孫曉冬，楊麗梅，張朝暉，崔鳳云

植物生長調節劑（plant growth regulators，PGRs）是一類人工合成的，具有和植物內源激素具有相似生理功效和相似化學結構的化學合成物[1]。根據發揮的生理功效的作用不同，可以分為生長促進劑、生長抑制劑、生長延緩劑[2]。已有科學研究表明，PGRs的使用可使蔬果產量增加5%～30%，國際上已把PGRs作為21世紀農業實現超產的主要措施之一[3]。但PGRs本身也屬于農藥的一類，某些化合物也具有明顯的慢性毒性[4]，需要規范其使用。隨著PGRs的使用日益廣泛，盲目或過量使用的情況時有發生，影響到了農產品的品質安全，例如2011年爆發的“西瓜爆炸”事件和“激素黃瓜”事件，特別是各種反季節蔬菜水果的出現尤為突出，個頭增大、顏色改變、味道平淡、果體畸形等現象加重了人們對食品安全問題的擔憂[5]。各國在PGRs的使用上均制定了相關法規，我國在即將實施的GB 2763—2016《食品中農藥最大殘留量》[6]中將作為PGRs使用的農藥范圍擴大到了14種，使用范圍涉及10余種產品。各國部分植物生長調節劑的限量值對比見表1。

表1 各國植物生長激素限量值對比Table 1 Comparison of maximum residue limits for plant growth regulators among different countries mg/kg

植物生長調節劑的測定目前主要方法有酶聯免疫法[10]、氣相色譜法[11]、氣相色譜-質譜法[12-13]、液相色譜法[14]、液相色譜-質譜法[15-19]。其中液相色譜-串聯質譜法作為分析領域最有力的技術手段，具有前處理靈活簡便、無需衍生化反應、能夠達到較低檢出限和強大的定性能力等優點，成為PGRs殘留分析中常見的方法，國內外已有采用液相色譜-串聯質譜法測定PGRs殘留量的報道[15-18]，但這些報道涉及化合物種類不多，極少能夠涵蓋3大類PGRs。前處理技術上，已有包括液液微萃取[20]、低溫液液分配[21]、微波輔助萃取[22]、固相萃取法[23]等。QuEChERS法最初用于果蔬中農藥殘留檢測，后被推廣至更大的檢測范圍和基質中，成為農藥殘留快速前處理技術的首選[24-29]。本實驗通過優化QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）各類填料的不同配比，優化超高效液相色譜-質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）條件，考察精密度、靈敏度、回收率等指標，建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS法同時測定蔬果中34 種植物生長調節劑殘留的方法。本方法快速、靈敏，可滿足高通量測定水果中多種植物生長調節劑的殘留，可為建立其他基質中相關化合物殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、甲酸、甲苯（均為色譜純）美國Fisher公司；三鍵鍵合硅膠C18粉末、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）粉末 美國Waters公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、增強型基質去除EMR（enhanced matrix remove）粉末 美國Agilent公司；氧化鋯包覆硅膠（Z-sep）粉末 美國Sulpeco公司；無水硫酸鎂、醋酸鈉、氯化鈉、二水合檸檬酸鈉、三水合二檸檬酸二鈉、硫酸鈉（均為分析純） 北京化學試劑廠。

34 種植物生長調節劑標準品：吲哚乙酸（CAS：87-51-4）、吲哚丁酸（CAS：133-32-4）、α-萘乙酸（CAS：86-87-3）、2,4-二氯苯氧乙酸（CAS：94-75-7）、2,4-二氯苯氧乙酸乙酯（CAS：533-23-3）、4-氯苯氧乙酸（CAS：122-88-3）、2-萘氧乙酸（CAS：120-23-0）、6-芐基腺嘌呤（CAS：1214-39-7）、吲熟酯（CAS：27512-72-7）、氯吡脲（CAS：68157-60-8）、環丙酸酰胺（CAS：113136-77-9）、玉米赤霉烯酮（CAS：17924-92-4）、赤霉素（CAS：77-06-5）、玉米素（CAS：1637-39-4）、馬來酰肼（CAS：123-33-1）、脫落酸（CAS：14375-45-2）、噻苯隆（CAS：51707-55-2）、2,3,5-三碘苯甲酸（CAS：88-82-4）、莠去津（CAS：1912-24-9）、西瑪津（CAS：122-34-9）、滅草松（CAS：25057-89-0）、水楊酸（CAS：69-72-7）、三唑酮（CAS：43121-43-3）、胺鮮酯（CAS：10369-83-2）、矮壯素（CAS：999-81-5）、縮節胺（CAS：24307-26-4）、多效唑（CAS：76738-62-0）、丁酰肼（CAS：1596-84-5）、烯效唑（CAS：83657-22-1）、抗倒胺（CAS：82211-24-3）、抗倒酯（CAS：95266-40-3）、抑芽唑（CAS：76608-88-3）、增甘磷（CAS：2439-99-8）、戊唑醇（CAS：107534-96-3）（純度均大于95%） 德國Dr. Erenstofer公司。

1.2 儀器與設備

Xevo TQ-S三重四極桿質譜儀（配有Acquity UPLC儀及電噴霧離子源） 美國Waters公司；Thermo X1R高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；Milli Q超純水系統 美國Millipore公司；GM200刀式研磨儀 德國Retsch公司；ENVI-氮吹儀 美國OA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

稱取適量標準品，分別用乙腈配制成1 000 μg/mL的標準儲備液，存放在－20 ℃環境中，可保存6 個月。根據實驗需要用乙腈稀釋成標準工作液或混合標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g均質后的樣品于聚四氟乙烯離心管中，根據樣品含水量情況，加入適量水，充分渦旋混勻后，加入10 mL乙腈，渦旋提取1 min，加入除水劑（4 g無水硫酸鎂＋1 g氯化鈉＋1 g二水合檸檬酸鈉＋0.5 g三水合二檸檬酸二鈉），劇烈振搖1 min，如樣品板結，則視情況加入陶瓷均質子。在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液7.5 mL，根據樣品狀態，加入不同凈化管中，具體如下：常規樣品：凈化管含150 mg C18、900 mg MgSO4；高葉綠素樣品：凈化管含150 mg C18、900 mg MgSO4、50 mg GCB，渦旋混勻后加入700 μL甲苯；高花色苷樣品：凈化管含300 mg Z-sep、900 mg MgSO4；高油脂樣品：凈化管含400 mg EMR；凈化管渦旋振搖2 min后，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取4 mL上清液，在40 ℃條件下用微弱氮氣流吹至近干，用1 mL初始流動相溶液復溶后，經0.22 μm濾膜過濾后，上機測定。

1.3.3 UPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱：Waters Acquity HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：45 ℃；流動相：A相為乙腈，B相為水；流速：0.4 mL/min；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序如表2所示。

質譜條件：采用電噴霧離子源；正負離子切換模式；多反應監測分段掃描模式（其中第1段正離子模式0.0～3.0 min，第2段正離子模式3.0～5.5 min，第3段正離子模式7.8～10.0 min，第4段正離子模式5.5～7.8 min，第5段負離子模式0.0～3.5 min，第6段負離子模式3.5～6.5 min，第7段負離子模式6.5～10.0 min）；毛細管電壓3.00 kV（＋）及2.00 kV（－），錐孔氣流量150 L/h；脫溶劑氣溫度450 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h；霧化氣壓力0.7 MPa；34 種植物生長調節劑的定量、定性離子對、錐孔電壓和碰撞電壓見表3。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

表3 34 種植物生長調節劑的質譜參數Table 3 Mass spectrometric parameters for 34 plant growth regulators

續表3

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

用甲醇分別配制30 ng/mL的標準品，通過蠕動泵以10 μL/min注入持續進樣，與0.05 mL/min的流動相共同進入質譜儀中。化合物進入電噴霧離子源后，均能夠形成穩定的母離子，在一級質譜模式下，調節錐孔電壓使得母離子的豐度最大。開啟二級質譜后，逐漸增大碰撞能量，觀察記錄離子碎片，選擇相對豐度較高，出峰穩定的碎片，微調碰撞能量，使得碎片離子的豐度最大。各化合物質譜參數的優化結果見表3，34 種植物生長調節劑在各自優化的錐孔電壓下，能夠得到最強的母離子響應，同時在優化的碰撞電壓下，可以得到穩定、響應較強的子離子，對比得到的兩個碎片離子，選擇干擾較小、豐度較高的碎片作為定量離子，另一個作為定性離子。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

實驗對比Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters Acquity HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters Acquity CORTECS C18（50 mm×2.1 mm，1.6 μm）、Waters Acquity CSH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Thermo Hypersil Gold（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱對待測組分分離的效果。由于多組分分析方法的建立中需要兼顧極性差異較大的各種化合物，其中，HSS T3可以耐受更高比例的水相，在98%比例的水相條件下可以使得強極性化合物（丁酰肼、矮壯素等）保留更好（表4），同時在全時間段上可以均勻出峰，因此，選取Waters Acquity HSS T3色譜柱作為分析柱。

表4 強極性化合物在不同色譜柱上保留時間對比Table 4 Comparison of retention time of compounds with high hydrophobicity on different columns min

2.2.2 流動相的選擇

由于采取正負切換離子模式采集，在選擇流動相的條件時，不僅要關注正離子電離化合物的響應，更重要的是負離子電離化合物在流動相影響下的峰形及響應情況。實驗選擇了乙腈、甲醇及二者的比例溶液作為強洗脫相；水、含0.1%甲酸溶液、含5 mmol/L乙酸銨溶液、含5 mmol/L甲酸銨溶液作為弱洗脫相，對其不同搭配進行了對比。

對比甲醇和乙腈作為流動相對分離的影響，明顯在使用乙腈作為有機相時，分離度更好。同時乙腈作為前處理QuEChERS法的提取溶劑，更有兼容性。對比不同酸度調節劑下的水溶液作為弱洗脫相時的分離情況，在使用含0.1%甲酸溶液（pH值約為3.6）時，包括水楊酸、4-氯苯氧乙酸等負離子電離化合物的定性離子出峰情況均不理想，雖然正離子的電離被增強，但是已經超出了檢測所需的必要度。對比含有5 mmol/L乙酸銨及甲酸銨溶液及純水作為流動相時的情況，可以看到含有緩沖鹽的情況下，各峰之間的分離度較好，但某些負離子電離化合物定性離子的出峰情況仍不理想（如水楊酸）。采用乙腈-水作為流動相各峰分離度好，負離子電離化合物也能夠保證定性離子有足夠響應，能夠滿足實驗設計所需。圖1為34 種植物生長調節劑的總離子流色譜圖。

圖1 34 種植物生長調節劑總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of 34 plant growth regulators

2.3 提取溶劑的選擇

乙腈作為QuEChERS法最常用的提取溶劑，具有對農藥優良的溶解性，實驗考察不同提取溶劑對目標化合物提取效率的影響，包括乙腈、0.1%甲酸-乙腈、2%甲酸-乙腈、0.1%氨水-乙腈。如圖2所示，乙腈具有較好的提取效率。這是由于目標化合物中具有酸性及堿性化合物，采用中性提取溶液可以更好地兼顧二者的提取。根據樣品狀態不同，加入適量水可以形成飽和鹽溶液，促進化合物的分配平衡向有機相移動，從而提高提取效率。

圖2 提取溶劑對34 種植物生長調節劑平均回收率的影響Fig. 2 Effect of extraction solvents on average recoveries of 34 PGRs

2.4 脫水劑及配比的選擇

QuEChERS法經過諸多應用，已經被證明為農藥殘留檢測的首選前處理方法之一[18-19]。在QuEChERS方法發展的過程中，提取步驟所用到的除水劑種類不斷變化，配比也不斷調整，以達到最優的除水效果和鹽析后的最佳提取效率。本實驗考察了5 種不同的脫水劑及配比對34 種植物生長調節劑的提取效率，分別為：A. 4 g無水硫酸鎂＋1 g氯化鈉（原始QuEChERS法）[30]；B. 6 g無水硫酸鎂＋1.5 g乙酸鈉（AOAC 2007.01法）[31]；C. 4 g無水硫酸鎂＋1 g氯化鈉＋1 g檸檬酸鈉＋0.5 g三水合二檸檬酸二鈉（CEN 15662法）[31]；D. 4 g無水硫酸鈉＋1 g氯化鈉（獸藥QuEChERS法）[32]；E. 1.6 g無水硫酸鎂＋0.4 g氯化鈉（QuEChERS EMR）。在提取管中分別加入0.5 mL 1 μg/mL的混合標準溶液，加入10 mL乙腈和1 mL水（QuEChERS EMR管由于容量限制，加入0.25 mL標準溶液，5 mL乙腈和0.5 mL水），劇烈振搖2 min，渦旋5 min后，離心取上清液0.5 mL與0.5 mL水混勻進樣。

圖3 脫水劑對34 種植物生長調節劑平均回收率的影響Fig. 3 Effect of different dehydration agents on average recoveries of 34 PGRs

對比各化合物在不同脫水劑作用下的提取效率（圖3），結果表明，CEN 15662法的提取效率最優，這可能是因為檸檬酸鹽的存在形成了穩定的緩沖體系，使得某些對pH值敏感的植物生長調節劑能夠被有效提取出來。故選擇4 g無水硫酸鎂＋1 g氯化鈉＋1 g檸檬酸鈉＋0.5 g三水合二檸檬酸二鈉作為脫水劑。

2.5 凈化填料及配比的選擇

PSA、C18和GCB是QuEChERS法中最常用的凈化填料，隨著研究的進步，不斷有更有針對性的新型填料被開發應用于QuEChERS方法中。例如Supelco公司的Z-sep（氧化鋯包覆硅膠）、Z-sep＋（C18鍵和氧化鋯硅膠）填料[33]，Agilent公司的EMR（增強型基質去除）填料[34]等。實驗對比了凈化填料不同組成和配比對實驗回收率的影響。具體選擇及配比見表5。

表5 凈化方法優化過程中嘗試的不同組成和配比Table 5 QuEChERS absorbents tested in this study

表5表明，由于目標化合物中α-萘乙酸、水楊酸等酸性PGR的存在，因此PSA不適合用于凈化策略當中，對比方案4、7、8、9、10等，雖然都能達到較好的回收率，但對于不同狀態的果蔬基質，去除雜質干擾的能力依然有不同，且可為互補。方案9僅有除水用MgSO4，對各類雜質均沒有理想的清除效果；對于菠菜等葉綠素含量較高的基質，方案10中的GCB可以有效清除雜質，但對萘乙酸、吲熟酯、6-BA等平層結構化合物的回收率會有較大影響，在凈化過程中加入適量甲苯可以改善回收率；對于提子、草莓等花色苷含量較高的基質，方案8中，氧化鋯包覆硅膠Z-sep基質可有效去除花色苷，清除效果非常明顯，且對回收率無較大影響；對于特殊含油脂較高的鱷梨基質，EMR粉末可以用于清除其中的脂質雜質，也可達到較為滿意的凈化效果；其余常規的水果蔬菜，如黃瓜、蘋果、豆芽、梨等不含有較多色素、蠟質、脂肪等雜質的基質，使用MgSO4清除水分、C18填料清除低極性雜質后即可測定。在菠菜、梨、提子、牛油果等典型基質中34 種植物生長調節劑使用不同凈化方案的平均回收率見圖4。

圖4 不同凈化方案的平均回收率Fig. 4 Average recoveries of plant growth regulators by different purification methods

2.6 基質效應的評價

圖5 植物生長調節劑在不同基質中的基質效應范圍Fig. 5 Matric effect ranges of plant growth regulators in different matrixes

根據GB 2763—2016[6]中對水果類別的分類，本方法選取了常規樣品、高葉綠素樣品、高花色苷樣品、高油脂樣品的代表性基質進行了方法驗證。基質效應根據空白加標基質響應值與溶劑標樣響應值的比值進行評價。基質效應大于0時為基質增強效應，小于0為基質抑制。對于基質效應過強的樣品，應采取相應的處理手段以減小其對測定的干擾。圖5為菠菜（高葉綠素樣品）、梨（常規樣品）、提子（高花色苷樣品）、牛油果（高油脂樣品）等典型基質中，測定得到的34 種化合物基質效應的范圍。可以看出，各基質對于植物生長調節劑的基質效應均較明顯，并且多表現出基質抑制效應，為消除基質效應帶來的影響，采取基質加標曲線進行校正。

2.7 標準曲線、檢出限和定量限實驗結果

在空白梨樣品中添加5、10、20、50、80、100 μg/kg系列水平的混合標準溶液，按前處理步驟處理后上機測定，按信噪比3∶1得到目標化合物的檢出限，10∶1得到目標化合物的定量限。以質譜響應值為縱坐標，添加量為橫坐標，繪制基質加標工作曲線，得到本方法的線性范圍，回歸曲線方程及相關系數，結果見表6。

表6 34 種植物生長調節劑的標準曲線、相關系數、線性范圍、檢出限及定量限Table 6 Standard curves, linear ranges, correlation coefficients, LODs and LOQs for 34 plant growth regulators

2.8 回收率和精密度實驗結果

分別取典型基質的空白樣品，包括菠菜（高葉綠素樣品）、梨（常規樣品）、提子（高花色苷樣品）、牛油果（高油脂樣品），添加低、中、高3 個水平的34 種植物生長調節劑混合標準溶液，進行前處理，測定目標化合物。每個水平進行6 次實驗，結果見表7，34 種植物生長調節劑的平均回收率為70.6%～118.3%，相對標準偏差為0.3%～14.9%。

續表7

表7 典型基質中34 種植物生長調節劑的回收率和相對標準偏差（n=6）Table 7 Average recoveries and RSDs of 34 plant growth regulators in typical matrix (n= 6)

續表7

2.9 方法穩定性的考察結果

變異系數/%吲哚乙酸 81.47 0.79 84.50 12.28 91.53 1.18 6.02吲哚丁酸 84.97 4.73 91.73 10.58 91.90 1.99 4.42 α-萘乙酸 79.33 2.46 94.47 9.00 83.37 5.94 9.14 2,4-D 84.83 5.29 92.43 9.94 88.93 4.49 4.29 2,4-D乙酯 93.03 2.13 93.43 8.51 92.03 5.33 0.78 4-氯苯氧乙酸 86.87 0.47 92.83 9.77 83.33 3.07 5.48 2-萘氧乙酸 84.37 3.57 91.27 2.69 91.60 5.87 4.58 6-芐基腺嘌呤 92.30 7.35 96.63 10.22 90.10 4.90 3.57吲熟酯 88.00 3.25 75.47 11.78 86.00 10.09 8.10氯吡脲 101.67 5.57 75.87 6.93 89.72 6.39 14.49環丙酸酰胺 96.57 1.65 88.70 8.98 85.43 4.64 6.34玉米赤霉烯酮 96.10 6.65 95.57 12.70 94.53 3.88 0.83赤霉素 93.67 6.69 99.93 6.43 90.57 2.14 5.04玉米素 89.60 3.03 97.87 8.98 93.10 4.19 4.44馬來酰肼 89.30 3.05 91.97 7.55 79.60 8.88 7.48脫落酸 87.37 3.21 86.23 0.87 93.50 5.55 4.39噻苯隆 92.93 6.27 94.47 1.86 91.70 7.52 1.49 2,3,5-三碘苯甲酸 88.63 2.01 83.60 3.19 85.80 3.88 2.93莠去津 96.73 7.10 95.03 7.40 90.87 1.23 3.20西瑪津 93.40 1.02 93.13 7.23 90.13 3.43 1.97滅草松 87.40 5.97 85.10 9.11 94.70 6.85 5.63水楊酸 82.37 0.67 100.07 7.72 75.90 3.69 14.53三唑酮 100.83 7.45 100.00 11.54 84.03 2.94 9.97胺鮮酯 89.63 5.92 94.73 9.69 89.27 1.79 3.35矮壯素 92.13 6.96 87.17 13.45 85.57 1.28 3.88縮節胺 95.40 4.41 86.57 7.18 78.83 3.19 9.54多效唑 88.47 6.70 96.17 12.20 87.67 4.38 5.17丁酰阱 90.17 2.44 77.73 10.92 89.40 2.47 8.12烯效唑 92.33 7.98 96.23 10.80 85.97 3.37 5.66抗倒胺 88.97 3.56 87.27 14.17 77.33 4.25 7.43抗倒酯 101.37 6.23 95.13 6.93 91.60 4.32 5.15抑芽唑 80.20 2.94 94.73 14.00 89.37 5.14 8.34增甘膦 99.93 1.71 92.63 6.13 81.10 2.83 10.41戊唑醇 86.27 4.77 75.63 7.50 93.03 4.09 10.32化合物 平均回收率/%實驗室1 實驗室2 實驗室3 批間變異系數/%變異系數/%平均回收率/%變異系數/%平均回收率/%

通過將該方法在3 家技術機構進行應用，得到在不同條件下實驗結果的批內及批間變異系數（表8），評價方法的穩定性。每個實驗室均采用3 個水平的加標樣品進行6 個水平的測定。從得到的結果可以看出，批內及批間變異系數均小于15%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測 實驗室質量控制規范食品理化檢測》中關于方法變異系數的要求。

2.1 0 實際樣品測定結果

隨機選取市售水果蔬菜150 個，包括菠菜、芹菜、桃、蘋果、青椒、桑葚、葡萄、牛油果、柑橘等樣品。 應用建立的方法對樣品進行34 種植物生長調節劑快速篩查，結果如圖6所示，小油菜在樣品中檢出多效唑（27.8 μg/kg），在油桃樣品中檢出脫落酸（18.16 μg/kg）等藥物。

圖6 樣品中檢出多效唑、脫落酸的提取離子流圖Fig. 6 Extracted ion chromatograms of paclobutrazol and abscisic acid in positive samples

3 結 論

利用基質分散固相萃取技術結合UPLC-MS/MS技術建立了常見水果、蔬菜中植物生長調節劑多指標同步定量檢測技術，該方法使用QuEChERS技術，針對不同的樣品基質，選取不同的凈化填料進行樣品凈化，使用超高效液相色譜分離，電噴霧串聯四極桿質譜測定，基質匹配外標峰面積法定量。得到了良好的方法靈敏度及回收率。相比于已有方法，擴大了化合物監測范圍，有針對性進行凈化策略的選擇，也能夠有效降低測定中的干擾。經方法學驗證，該方法滿足殘留檢測的技術要求，可應用于食品安全日常監測及突發事件應急處置工作當中。

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