基于酪蛋白自組裝法制備α-生育酚/酪蛋白納米粒及其α-生育酚穩定性分析

何 盼，徐偉麗,*，米雅清，何勝華，李 洋，佟云嬌

α-生育酚（α-tocopherol，α-TOC）廣泛分布在動植物油中，其化學結構式為C29H50O2，分子結構式如圖1所示[1-2]。α-TOC為淡黃色油狀液體，不溶于水，在無氧條件下即使加熱到200 ℃也不易分解，但對氧十分敏感，其在堿性條件下特別容易氧化[3-4]。一般認為生育酚的主要功能是抗氧化作用，其在人體內的抗氧化作用主要表現為延緩衰老、抗不育、提高免疫力等，在醫學上廣泛用于治療心血管疾病、抗腫瘤和預防衰老，并取得了良好的效果[5-7]。但由于α-TOC不溶于水，很難添加于食品中，又因為其結構特性，易被氧化破壞，使得生物利用率較低甚至失去生物活性，使α-TOC在儲藏和應用方面存在一定的局限性。采用納米體系對其進行保護是目前解決這一問題最有效的手段之一。

酪蛋白（casein，CN）廣泛存在于牛奶中，在牛奶中形成的高度水合膠粒稱為CN膠束[8-10]，CN表面的兩親基團使CN包埋疏水性分子的同時可形成納米粒子懸液[11-18]。由于CN能自組裝成納米粒從而成為包埋營養物質的良好載體[19-23]；其自身也具有較高的營養價值，水解后可以產生生物活性肽和多種氨基酸，在人體內具有其他生理作用[10]。因此選擇CN作為載體，通過自組裝形成α-TOC/CN納米顆粒并測試其穩定性，從而改善α-TOC的光敏性、熱敏性、易氧化等加工適應性，保持其原有的化學特性和生物活性，并實現可控釋放，為解決α-TOC的應用局限性提供參考，以期擴大α-TOC在食品加工中的應用和深化CN資源的開發利用。

圖1 α-TOC結構式Fig. 1 Structure of α-TOC

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-TOC、酪蛋白酸鈉 美國Sigma公司；檸檬酸三鉀 天津市致遠化學試劑有限公司；磷酸氫二鉀天津市天力化學試劑有限公司；無水氯化鈣 天津市光復精細化工研究所；鹽酸 哈爾濱伊世達有限公司；氫氧化鈉 天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA223S型電子分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；pHS-3C型實驗室pH計 上海偉業儀器廠；101-2A型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；79-3型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器廠；XMTD-3302型電熱恒溫水浴鍋、RHYG-4S型電動攪拌器 常州市人和儀器廠；NanoZS90型激光粒度儀 英國Malvern儀器有限公司；Quanta x50 FEG掃描電鏡 FEI香港有限公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀、SuperModulyo型真空冷凍干燥機 美國Thermo Fisher公司；H-7650透射電子顯微鏡、F-2700熒光分光光度計 日本Hitachi公司；UV-2100型紫外-可見光分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；BCD-221型4 ℃冰箱 河南新飛電器集團有限公司；BCD-208K/A型－20 ℃冰箱 青島海爾有限公司；Winne801光相關納米粒度儀 濟南微納顆粒儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-TOC/CN納米粒的制備

α-TOC溶液的制備：250 mg α-TOC溶于10 mL無水乙醇中，充分溶解后4 ℃避光保存。

根據Semoet等[24]的方法制備重組CN膠束：在200 mL 5%酪蛋白酸鈉溶液（溶于蒸餾水中）中加入3 mg α-TOC（對照只加同體積乙醇）、4 mL 1 mol/L檸檬酸三鉀、24 mL 0.2 mol/L K2HPO4溶液和20 mL 0.2 mol/L CaCl2溶液。而后每隔15 min在37 ℃恒溫浴邊攪拌邊加入2.5 mL 0.2 mol/L K2HPO4溶液和5 mL 0.2 mol/L CaCl2溶液，共計8 次。使用0.1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液調節pH值為6.7，用蒸餾水定容到400 mL。然后適度攪拌1 h（350 r/min），每個實驗都重復進行。

樣品和對照分散體系（10 mL）被放置在擰緊蓋的20 mL小瓶中，于74 ℃恒溫水浴熱處理20 s以便更好地形成自組裝粒子。

1.3.2 單因素試驗

以熒光強度為評價指標，固定其他條件按照上述制備方法分別對組裝溫度（25、28、32、37、44、48 ℃）、α-TOC與CN質量比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500）、pH值（6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）進行單因素試驗。使用熒光光度計測定相對熒光強度，其中激發波長為301 nm，發射波長為409 nm（稀釋倍數為2）。以確定自組裝法的最佳組裝溫度、質量比和pH值。

1.3.3 α-TOC/CN納米粒的表征

1.3.3.1 粒徑測定

將α-TOC/CN納米粒用激光粒度儀分析其粒徑，對照組用200 mL 5%的酪蛋白酸鈉溶液定容至400 mL。粒徑測定參照Thiebaud等[25]的方法：用去離子水將樣品稀釋至原來體積的1/10，室溫靜置1 h，以破壞CN膠束。接著再稀釋至1/1 000，稀釋液于20 ℃適度攪拌。取100 mL處理好的樣品用激光粒度儀進行粒徑分析。

1.3.3.2 形貌觀察

將干燥后的納米顆粒噴金，在Quanta x50 FEG掃描電鏡下（加速電壓5 kV）觀察外部形態。取一滴納米溶液加到銅網上，采用漂浮法進行負染，負染劑為3%鈾染色，負染時間為35 s，置于透射電鏡下觀察形貌（加速電壓80 kV）。

1.3.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

將納米顆粒壓片后進行衰減全反射傅里葉變換紅外光譜分析，波數范圍為400～4 000 cm－1，分辨率為4 cm－1。

1.3.4 α-TOC含量的測定

1.3.4.1 α-TOC包封率和載藥量計算

CN重組裝后的體系中除有包埋的α-TOC，還有游離的α-TOC。測定α-TOC總質量和游離α-TOC質量，按公式（1）和（2）計算納米粒的包封率和載藥量：

1.3.4.2 α-TOC標準曲線的繪制

精確稱取200 mg 93% α-TOC醇溶液溶于50 mL正己烷中，待完全溶解后用正己烷定容至100 mL，配制成2 mg/mL的α-TOC溶液，作為標準品備用液。取1 mL樣品溶液置于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，作為工作液。精確吸取工作液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻。用正己烷作空白，用紫外分光光度計于297 nm波長處分別測定標準溶液的吸光度，以α-TOC質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得出線性回歸方程為y=0.006 4x－0.003 5，R2=0.999 6。

1.3.4.3 樣品游離α-TOC質量的測定

游離的α-TOC用膜分離方法獲得：4 000×g離心30 min，游離的α-TOC會滲透到濾液接收器，封裝在CN納米顆粒的α-TOC會留在過濾裝置。濾液中得到的游離α-TOC先用氮氣流除去乙醇，然后用正己烷提取至適當的濃度，最后徹底渦旋，用紫外分光光度計測定在297 nm波長處的吸光度。代入回歸方程，算出游離α-TOC的質量。

1.3.5 α-TOC/CN納米粒穩定性的測定

將α-TOC/CN納米粒于培養皿中－20 ℃冷凍過夜，放入冷凍干燥機真空干燥48 h，調蒸餾水pH值至與樣品pH值相同，用其溶解凍干樣品并用相關納米粒度儀測定粒徑大小。

1.3.5.1 貯存穩定性

實驗設置4 ℃以及室溫2 個條件，將樣品在4 ℃（或室溫）避光貯存48 h后與無水乙醇等體積混合磁力攪拌，加入200 μL 1 mol/L NaOH溶液，用正己烷對α-TOC進行萃取，直到水相呈無色透明。正己烷相于297 nm波長處測定吸光度，根據公式（3）計算保留率：

1.3.5.2 組裝溫度對α-TOC穩定性的影響

將實驗組和對照組樣品分別置于60 ℃下避光保存48 h，計算保留率。

1.3.5.3 氧化劑對α-TOC穩定性的影響

將實驗組與對照組樣品各取1 mL分別加入1 mL 20 μg/mL FeCl3溶液，室溫避光保存48 h，計算保留率。

1.4 數據分析

采用SPSS 13.0軟件進行顯著性分析，采用單因素Duncan法進行多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 組裝溫度對α-TOC/CN納米粒相對熒光強度的影響

CN能夠發出熒光，當α-TOC與CN形成α-TOC/CN納米粒時，CN的疏水基團發生熒光淬滅[26]，自組裝包埋形成的α-TOC/CN納米粒相對熒光強度比未包埋的α-TOC相對熒光強度低。因此，可以通過測定相對熒光強度的大小來反映復合納米粒的結合強度。

組裝溫度的改變會影響CN結構上的變化，從而影響α-TOC/CN納米粒的結合，因此確定最適操作溫度會提高納米粒的結合強度。取3 mg α-TOC于400 mL CN溶液中（pH 6.7），對不同組裝溫度下制備的α-TOC/CN納米粒相對熒光強度的測定結果如圖2所示，結果表明：在25～37 ℃范圍內，相對熒光強度波動不大；當37～48 ℃時，相對熒光強度逐漸增大，這可能是由于溫度升高導致蛋白質部分變性使得大部分α-TOC與CN不能緊密的結合。由圖2可知，組裝溫度為37 ℃左右時，納米粒的相對熒光強度最小（P＜0.05），結合程度最高。

圖2 組裝溫度對α-TOC/CN納米粒的影響Fig. 2 Effect of temperature on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanocomposites

2.1.2 α-TOC與CN質量比對α-TOC/CN納米粒相對熒光強度的影響

據于鈺等[10]實驗研究，納米復合物的包埋程度受原料量的影響，因此本實驗通過測定α-TOC與CN質量比以確定CN對α-TOC的包埋程度。在pH 6.7、組裝溫度37 ℃條件下，對不同質量比條件下制備的納米粒相對熒光強度測定結果如圖3所示，結果表明：質量比在1∶5～1∶100時，相對熒光強度變化不大，可能是由于與CN結合的α-TOC有限，導致α-TOC大部分都還處于未結合狀態，從而導致這一范圍內相對熒光強度高且變化不大，當質量比為1∶100～1∶300時，相對熒光強度急劇下降，納米粒結合的程度較高，其原因可能是在質量比為1∶100時雖然α-TOC的含量較高但其大部分以微晶形式存在，使得進入CN被包埋的較少，而在質量比1∶300時α-TOC是以分子形式存在，更易于結合到CN的疏水微區中，使得兩者的結合程度較高[10]，而質量比為1∶300～1∶500時，相對熒光強度又逐漸增加，這可能是由于隨著質量比的減小，溶液中α-TOC雖都能達到最大程度的結合，但未包埋的CN增多，所以其相對熒光強度又逐漸升高。因此當α-TOC與CN質量比為1∶300時，α-TOC與CN結合程度較高（P＜0.05）。

圖3 α-TOC與CN質量比對α-TOC/CN納米粒的影響Fig. 3 Effect of α-TOC to sodium caseinate ratio on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanoparticles

2.1.3 pH值對α-TOC/CN納米粒相對熒光強度的影響

pH值的變化會改變聚合物的帶電狀態，從而影響聚合物分子之間的靜電作用、鹽鍵作用、氫健作用和疏水作用以及聚合物分子結合程度[11]。在組裝溫度37 ℃、α-TOC與CN質量比為1∶300的條件下，對不同pH值下制備的α-TOC/CN納米粒熒光強度的測定結果如圖4所示。結果表明：隨著pH值的升高，納米粒相對熒光強度呈現先減小后增大的趨勢，在pH值為6.8時，納米粒相對熒光強度最小（P＜0.05），結合程度最高，這可能是由于在pH 6.8時使得α-TOC與CN疏水基團氫鍵結合能力最強，使得其相對熒光強度最小，同時Sáiz-Abajo等[27]也表示在利用CN自組裝時在pH 6.7附近效果最佳。因此選用pH 6.8為制備α-TOC/CN納米粒最佳pH值。

圖4 pH值對α-TOC/CN納米粒的影響Fig. 4 Effect of pH value on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanoparticles

2.2 α-TOC/CN納米粒的表征結果

2.2.1 α-TOC/CN納米粒粒徑

圖5 α-TOC/CN納米粒粒徑的測定Fig. 5 Particle size distribution of α-TOC/CN nanoparticles

由圖5可知，α-TOC/CN納米粒平均粒徑為（135.6±13.7）nm，粒徑范圍為80.3～306.5 nm，且多分散系數為0.157，表明經自組裝后納米顆粒分散性良好，粒徑分布較均勻，體系穩定，適合用于后期研究[28]。

2.2.2 形貌觀察

最佳條件下所制備的α-TOC/CN納米粒掃描電鏡和透射電鏡結果如圖6所示，復合納米顆粒形狀類似圓狀，分散性良好，粒徑分布比較均勻，粒徑與之前用激光粒度儀所測的結果一致。

圖6 α-TOC/CN納米粒掃描電鏡圖（A）與透射電鏡圖（B）Fig. 6 SEM (A) and TEM (B) images of α-TOC/CN nanoparticles

2.2.3 傅里葉變換紅外光譜結果

α-TOC/CN納米粒與未包埋α-TOC的CN納米粒紅外光譜測試如圖7所示，3 000 cm－1附近的寬峰為CN中N—H鍵伸縮振動所致，α-TOC/CN納米粒在此處的吸收峰為3 300.25 cm－1，而對照CN納米粒的吸收峰為3 307.20 cm－1，通過對比可知，分子間、分子內氫鍵作用使得該峰的伸縮振動頻率向低波數方向移動，表明α-TOC與CN的氫鍵作用增強了[29]。而α-TOC/CN納米粒中1 659.14 cm－1及CN納米粒中1 658.96 cm－1峰均能說明兩者具有α-螺旋結構，有利于蛋白質在油水界面上快速吸附和定向。在920.20 cm－1處，α-TOC/CN納米粒出現了一小峰，可能是由于α-TOC與CN結合后引起CN中N—H面外彎曲振動引起的，再次證明了α-TOC與CN之間存在相互作用力。通過上述分析證明了α-TOC被成功包埋進入CN內部。

圖7 α-TOC/CN納米粒與CN納米粒的紅外光譜圖Fig. 7 FTIR spectra of CN and α-TOC/CN nanoparticles

2.3 α-TOC包封率和載藥量

圖8 α-TOC包封率和載藥量Fig. 8 Encapsulation efficiency and drug loading capacity of α-TOC

從圖8可以看出，隨著α-TOC加入量的增加，α-TOC/CN納米粒包封率先降低后增大，載藥量逐漸增大，在α-TOC與CN質量比為1∶10時包封率和載藥量都呈上升趨勢，該測量結果與于鈺[10]的研究結果相符合。質量比為1∶300～1∶100時，由于α-TOC含量增加，在溶液中以微晶形式存在的α-TOC也增多，使得α-TOC不易與CN結合，所以其包封率會逐漸下降。在α-TOC與CN質量比為1∶300時，包封率和載藥量分別為（97.97±7.38）%和（0.33±0.03）%。

2.4 α-TOC/CN納米粒的穩定性分析

2.4.1 凍干對納米粒粒徑的影響

將α-TOC/CN納米粒溶液進行凍干處理后，測定其粒徑結果如圖9所示，經凍干后的納米粒粒徑并未發生大幅改變（P＞0.05），因此可知α-TOC/CN納米粒具有良好的凍干穩定性。

圖9 凍干前后α-TOC/CN納米粒粒徑變化Fig. 9 Change in particle size of α-TOC/CN nanoparticles after freeze drying

2.4.2 4 ℃貯存穩定性

圖10 4 ℃避光30 d貯存α-TOC和α-TOC/CN的保留率Fig. 10 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN during 30 d storage at 4 ℃

由圖10可知，隨著貯存時間的延長，α-TOC保留率逐漸降低，但與純品α-TOC相比，α-TOC/CN納米粒保留率更高（P＜0.05），由此可知，在4 ℃條件下，經過CN的包埋提高了α-TOC的貯存穩定性。

2.4.3 室溫貯存穩定性

圖11 室溫避光貯存α-TOC和α-TOC/CN納米粒的保留率Fig. 11 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN during 30 d storage at room temperature

由圖11可知，隨著貯存時間的延長，雖然α-TOC/CN納米粒和α-TOC的保留率都逐漸降低，但與純品α-TOC相比，α-TOC/CN納米粒保留率更高且下降較緩慢（P＜0.05），因此可知室溫下經過包埋的α-TOC要比純品的α-TOC貯存穩定性好。

2.4.4 氧化劑對α-TOC穩定性的影響

綜合比較α-TOC/CN納米粒和α-TOC純品分別經4 ℃保存、室溫貯存、60 ℃加熱處理和氧化劑FeCl3處理避光保存48 h后所測得的保留率，結果如圖12所示。在各種處理中經過包埋的α-TOC要比未包埋的α-TOC保留率有所提高，其中4 ℃和FeCl3組α-TOC納米粒的保留率顯著提高。4 ℃處理的納米粒與對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05），故4 ℃貯存效果最好。

圖12 不同處理條件下α-TOC和α-TOC/CN保留率Fig. 12 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN with different treatments

3 結 論

采用自組裝法包埋疏水性α-TOC，在制備α-TOC/CN納米粒最佳條件的同時考察了不同條件下α-TOC/CN納米粒穩定性的變化。結果表明，當制備條件為組裝溫度37 ℃、pH 6.8、α-TOC與CN質量比1∶300時，α-TOC與CN結合較緊密，為制備納米復合物的最佳條件。所得納米粒平均粒徑為（135.6±13.7）nm，包封率為（97.97±7.38）%，載藥量為（0.33±0.03）%。納米粒大小均一且分散性較好。此外，經過凍干以及在不同溫度（4 ℃、室溫、60 ℃）和氧化劑FeCl3的處理后，由穩定性測試結果可知該納米粒具有良好的穩定性，其中在4 ℃下貯存該納米粒穩定性最好。用CN包埋α-TOC不僅提高了α-TOC的穩定性，同時在操作方法上較為簡單和經濟，除酸堿外未添加過多化學試劑，安全性高，符合食品加工標準，為CN進一步資源化利用提供了可能。

參考文獻：

[1] BASIRI L, RAJABZADEH G, BOSTAN A. Alpha-tocopherolloaded niosome prepared by heating method and its release behavior[J]. Food Chemistry, 2016, 221: 620-628. DOI:10.1016/j.foodchem.2016.11.129.

[2] SCHERF H, MACHLIN L J, FRYE T M, et al. Vitamin E biopotency:comparison of various ‘natural-derived’ and chemically synthesized α-tocopherols[J]. Animal Food Science Technology, 1996, 59: 115-126.DOI:10.1016/0377-8401(95)00892-6.

[3] GALLIA F, AZZIB A, BIRRINGERC M, et al. Vitamin E: emerging aspects and new directions[J]. Free Radical Biology and Medicine,2017, 102: 16-37. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2016.09.017.

[4] PEH H Y, TAN W D, LIAO W P, et al. Vitamin E therapy beyond cancer:tocopherol versus tocotrienol[J]. Pharmacology & Therapeutics, 2016,162: 152-169. DOI:10.1016/j.pharmthera.2015.12.003.

[5] BOREL P, DESMARCHELIER C. Genetic variations involved in vitamin E status[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2016,17(12): 2-11. DOI:10.3390/ijms17122094.

[6] SCHM?LZ L, BIRRINGER M, LORKOWSKI S, et al. Complexity of vitamin E metabolism[J]. World Journal of Biological Chemistry,2016, 7(1): 14-43. DOI:10.4331/wjbc.v7.i1.14.

[7] BOONNOY P, KARTTUNENCD M, WONG-EKKABUT J. Alphatocopherol inhibits pore formation in oxidized bilayers[J]. Physical Chemistry Chemical Physics, 2017, 19(8): 5699-5704. DOI:10.1039/c6cp08051k.

[8] TAVARESA G M, CROGUENNEC T, CARVALHOC A F, et al. Milk proteins as encapsulation devices and delivery vehicles:applications and trends[J]. Trends in Food Science & Technology,2014, 37(1): 5-20. DOI:10.1016/j.tifs.2014.02.008.

[9] ATAMER Z, POST A E, SCHUBERT T. Bovine beta-casein:isolation, properties and functionality[J]. International Dairy Journal,2017, 66: 115-125. DOI:10.1016/j.idahyj.2016.11.010.

[10] 于鈺. 酪蛋白自組裝納米粒的超聲制備及其應用[D]. 青島: 中國海洋大學, 2012: 2-14.

[11] 劉燕. 酪蛋白膠束結構與功能特性的研究[D]. 揚州: 揚州大學,2007: 1-20.

[12] 錢列生, 萵漢明. 食品微膠囊技術[J]. 中山大學學報論叢, 2007(9):201-205. DOI:10.3969/j.issn.1674-3202.2007.09.055.

[13] 殷婷, 管驍. 大麥醇溶蛋白負載白藜蘆醇自組裝納米顆粒及其性質研究[J]. 分析測試學報, 2015, 34(1): 67-72. DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.01.010.

[14] 孫歡利, 陳維, 程茹, 等. 納米靶向藥物釋放系統: 載體交聯與生物響應性藥物釋放[R]. 大連: 全國高分子學術論文報告會, 2011.

[15] 項惠丹. 抗氧化微膠囊壁材的制備及其在微膠囊化魚油中的應用[D]. 無錫: 江南大學, 2008: 1-7.

[16] QU B, ZHONG Q X. Casein-maltodextrin conjugate as an emulsifier for fabrication of structured calcium carbonate particles as dispersible fat globule mimetics[J]. Food Hydrocolloids, 2017, 66: 61-70.DOI:10.1016/j.foodhyd.2016.12.022.

[17] FAIZULLIN D A, KONNOVA T A, HAERTL T, et al. Secondary structure and colloidal stability of beta-casein in microheterogeneous water-ethanol solutions[J]. Food Hydrocolloids, 2017, 63: 349-355.DOI:10.1016/j.foodhyd.2016.09.011.

[18] ZHANG Z P, ZHANG R J, CHEN L, et al. Designing hydrogel particles for controlled or targeted release of lipophilic bioactive agents in the gastrointestinal tract[J]. European Polymer Journal, 2015,72: 698-716. DOI:10.1016/j.eurpolymj.2015.01.013.

[19] 周輝輝. 自組裝法制備核殼結構的茶多酚-明膠-葡聚糖符合凝聚膠束[D]. 長沙: 中南大學, 2012: 1-10.

[20] 許小丁, 陳昌盛, 陳荊曉, 等. 多肽分子自組裝[J]. 中國科學: 化學,2011, 41(2): 221-238. DOI:10.1360/032010-782.

[21] 闞茗銘, 葉發銀, 趙國華. 多酚-蛋白質共價作用及其對食品體系的影響研究進展[J]. 食品科學, 2015, 36(1): 245-249. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201501047.

[22] 代志凱, 周迪, 劉愛琴, 等. 辛烯基琥珀酸淀粉酯制備高含量β-胡蘿卜素微膠囊[J]. 中國食品添加劑, 2013(3): 180-185. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2013.03.024.

[23] BETZ M, KULOZIK U. Whey protein gels for the entrapment of bioactive anthocyanins from bilberry extract[J]. International Dairy Journal, 2011, 21(9): 703-710. DOI:10.1016/j.idairyj.2011.04.003.

[24] SEMO E, KESSELMAN E, DANINO D, et al. Casein micelle as a natural nano-capsular vehicle for nutraceuticals[J]. Food Hydrocolloids, 2007,21(5): 936-942. DOI:10.1016/j.foodhyd.2006.09.006.

[25] THIEBAUD M, DUMAY E, PICART L, et al. High-pressure homogenisation of raw bovine milk. Effects on fat globule size distribution and microbial inactivation[J]. International Dairy Journal,2003, 13(6): 427-439. DOI:10.1016/S0958-6946(03)00051-7.

[26] ESMAILI M, HHAFFARI S M, MOVAHEDI Z M, et al. Beta caseinmicelle as a nano vehicle for solubility enhancement of curcumin; food industry application[J]. LWT-Food Science and Technology, 2011,44(10): 2166-2172. DOI:10.1016/j.lwt.2011.05.023.

[27] SáIZ-ABAJO M J, GONZALEZ-FERRERO C, MORENO-RUIZ A, et al. Thermal protectionof β-carotene in re-assembled casein micelles during different processing technologies applied in food industry[J]. Food Chemistry, 2013, 138: 1581-1587. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.11.016.

[28] RAMPINO A, BORGOGNA M, BLASI P, et al. Chitosan nanoparticles: preparation, size evolution and stability[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2013, 455(1/2): 219-228. DOI:10.1016/j.ijpharm.2013.07.034.

[29] 顧小紅, 孟旭, 湯堅. 豆漿凝固過程中大豆蛋白質二級結構的研究[J]. 分析科學學報, 2006, 22(6): 675-687. DOI:10.3969/j.issn.1671-6132.2007.02.005.