高效液相色譜-電感耦合等離子質譜法分析富硒茶葉中硒的形態

陳貴宇，潘煜辰，李清清，冷桃花*，李君績，葛 宇

硒是一種人體必需的微量元素[1]。硒具有抗癌及抗衰老作用，能夠增強人體免疫力，調節人體維生素的吸收與利用，維持人體健康狀態[2]。硒攝入不足容易引起人體免疫力下降，導致許多疾病的發生，比如近視、白內障、肝癌、肺癌、白血病等[3]。硒的日攝入量至少需要維持30～40 μg，但也不是越多越好，日攝入量達到400 μg也會導致一些疾病的發生，比如頭發脫落、指甲變脆易脫落、神經系統異常等，引起人體代謝功能紊亂[4]。

我國很多地方都屬于缺硒地區，因硒缺少引起的地方病波及東北到西南的十多個省和自治區，所引發的疾病包括已發現的克山病和大骨節病等。日常人體硒的攝入主要來源于食物。動物內臟、水產品、蛋類等都是硒含量較高的食物；豆類、肉類蔬菜以及糧食也有少量的硒存在[5]。針對部分嚴重硒缺乏地區，一些富硒食品如富硒大米、富硒大豆、富硒雞蛋等也被研發出來，用于補充缺硒人群對硒的正常攝入，維持身體健康。

硒對人體的作用取決于硒的形態，人體對不同形態的硒吸收和利用都不同。硒存在的形態有很多種，比較常見的有硒酸根（Se（VI））、亞硒酸根（Se（IV））、硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（SeMC）、硒代蛋氨酸（SeMet）等。針對這些不同形態的硒化合物，也出現了許多相應的檢測分析方法[6-10]，分離硒化合物通常采用氣相色譜法[11]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12]、離子色譜法[13]以及毛細管電泳法[14]，檢測方法有原子吸收光譜法[15]、原子熒光光譜法[16]、電感耦合等離子發射光譜法[17]、電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法[18-28]。本實驗采用HPLC與ICP-MS聯用方法對5 種常見硒化合物進行分離檢測，該聯用技術具有分離效率高、檢出限低、精密度高、穩定性好等優點，適用于這5 種硒化合物的分離和檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SeCys2溶液（44.2 μg/g）、SeMC溶液（34.8 μg/g）、Se（IV）溶液（42.9 μg/g）、SeMet溶液（39.4 μg/g）、Se（VI）溶液（41.5 μg/g）（均以硒計） 中國計量科學研究院；檸檬酸（色譜純） 美國Sigma公司；其他化學試劑均為優級純；超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm） 美國Millipore公司；ICP-MS 7500cs調諧溶液（1 μg/L，Li、Mg、Y、Co、Tl、Co） 美國Agilent公司。

1.2 儀器與設備

7500型ICP-MS儀、1200 series型HPLC儀 美國Agilent公司；Hamilton PRP-X100（250 mm×4.1 mm，10 μm）色譜柱 瑞士Hamilton公司；AL204型萬分位電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；4-16K離心機 美國Sigma公司；超聲波清洗儀 上海科導超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 儀器工作參數

色譜分離條件：PRP-X100（250 mm×4.1 mm，10 μm）色譜柱；流動相A：10 mmol/L檸檬酸溶液；流動相B：超純水；流速：0.8 mL/min；進樣量：20 μL。洗脫梯度見表1。

表1 HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions of HPLC

ICP-MS工作條件：射頻功率1 500 W；霧化室溫度2 ℃；載氣流量0.5 L/min；輔助氣流量0.1 L/min；采樣模式：時間積分；分析時間1 200 s。樣品分析前用ICP-MS調諧液將儀器靈敏度調至最佳。

1.3.2 樣品前處理

稱取約0.2 g茶葉樣品于10 mL離心管中，加入1 mL 10 mg/mL的蛋白酶K溶液，加純水定容到10 mL，超聲1 h，10 000 r/min離心15 min，取上層清液經0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

圖1 流動相為100% A時硒化合物分離譜圖Fig. 1 Chromatograms of selenium species with 100% mobile phase A

本實驗根據文獻[29]報道，選用檸檬酸溶液為流動相，通過優化檸檬酸溶液的濃度確定最佳色譜分離條件。根據文獻[30]，如圖1a所示，10 mmol/L的檸檬酸溶液（pH 5.5）單一等度洗脫能較好的分離SeCys2、Se（IV）、SeMet、Se（VI）這4 種硒形態化合物，與文獻報道基本一致。但SeMC與Se（IV）在該流動相中卻無法分離（圖1b）。

圖2 不同比例流動相硒化合物分離譜圖Fig. 2 Chromatograms of selenium species with different mobile phase compositions

為了使得SeMC和Se（IV）兩種硒形態化合物能夠取得較好的分離度，以達到完全分離，本研究對流動相進行了進一步的研究。以檸檬酸溶液（流動相A）-水（流動相B）進行色譜分離條件的摸索，通過調節流動相A和B的比例，來實現SeMC和Se（IV）較好的分離，實驗分別研究了流動相A為100%、50%、10%、5%時兩種硒化合物的分離情況如圖2所示，最終發現在含5%的流動相A時，SeMC和Se（IV）兩種硒形態化合物可以完全分離。

圖3 硒化合物分離譜圖Fig. 3 Chromatograms of selenium species with isocratic and gradient elution

當流動相A-B（5∶95，V/V）時，5 種硒形態化合物得到了較好的分離，整個分離時間達到25 min左右（圖3a）。由于Se（VI）的分離時間過長，不但導致峰形變寬，而且導致分析成本增加，不利于實際樣品的快速檢測。由圖3a可知，SeCys2、SeMC、Se（IV）、SeMet在7 min內能夠全部分離，而 Se（VI）則在22 min左右出峰，因此，本研究考慮采用梯度洗脫，縮短Se（VI）的分離時間且不影響前面4 種硒形態化合物的分離度。研究表明，隨著流動相中檸檬酸溶液比例的增加，Se（VI）的出峰時間逐漸縮短。隨著檸檬酸濃度的增大，鹽含量高不利于ICP-MS的儀器保養，所以本研究綜合考慮采用了如表1所示的洗脫梯度，5 種硒形態化合物在較短的時間內全部得到了完全分離（圖3b），又能較好地保護儀器。

2.2 樣品前處理條件的優化

針對硒形態化合物的提取試劑常見的有水、鹽酸浸提和蛋白酶酶解等。本研究分別考察了以水、1%硝酸以及蛋白酶K溶液作為提取試劑對富硒茶葉中硒形態化合物的提取效果。結果表明，用水和1%硝酸溶液提取的溶液中未檢測到硒形態化合物，蛋白酶K溶液中有硒形態化合物檢出，這可能因為富硒茶葉中的硒形態化合物主要以硒蛋白和硒糖的形式存在，在水或1%硝酸溶液中溶解性較差，這一結果與文獻[30]報道相符。因此本研究采用蛋白酶K溶液作為提取試劑。確定好提取液后，比較了恒溫振蕩與超聲提取兩種提取方式的提取效率，結果通過超聲提取可以大大縮短實驗時間，提取效果良好。最后，又進一步優化了超聲提取時間以及蛋白酶K用量。

2.2.1 超聲時間的選擇

采用1.3.1節前處理方法，研究了超聲時間對SeMC提取量的影響。結果表明，隨著超聲時間的延長，SeMC提取量增加，在60 min后增加量趨于平緩（圖4）。因此，本實驗選取超聲60 min為最佳提取條件。

圖4 超聲時間對提取效率的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction efficiency

2.2.2 蛋白酶K用量的選擇

圖5 蛋白酶K用量對提取效率的影響Fig. 5 Effect of protease dosage on extraction efficiency

采用1.3.1節前處理方法，研究了蛋白酶K用量對SeMC提取量的影響，如圖5所示，結果表明，SeMC的提取量隨蛋白酶K用量的增加而增加，在用量為1 mL以上時增加量趨于平緩。因此，本實驗選取蛋白酶K用量1 mL為最佳提取條件。

2.3 標準曲線及檢出限結果

配制質量濃度分別為0、5、10、20、30、40、50 μg/L的一系列5 種硒化合物的混合標準溶液，在優化的實驗條件下考察方法的線性范圍，5 種硒化合物在0～50 μg/L的質量濃度范圍內線性良好（表2），線性相關系數R2不小于0.999 8。

表2 5 種硒化合物的標準曲線線性參數及檢出限Table 2 Linear correlation coefficients and detection limits of 5 selenium species

在空白樣品中加入5 μg/L的混合標準溶液，以3 倍基線噪音測定5 種硒化合物的檢出限分別為SeCys20.13 μg/L、SeMC 0.25 μg/L、Se（IV）0.24 μg/L、SeMet 0.65 μg/L、Se（VI）1.09 μg/L。

分別向樣品中加入5、25、50 μg/L 3 個水平的5 種硒化合物標準溶液，各平行處理6 個樣品，經扣除樣品空白后，5 種硒化合物的回收率在91.8%～109.4%之間，5 種硒化合物的相對標準偏差均在5%以內。

2.4 實際樣品的檢測結果

應用本研究優化的方法對富硒茶葉（產地為恩施，品種為綠茶）樣品進行測定，結果檢測出了SeMC和SeMet，如圖6所示，其中，SeMC含量為0.27 mg/kg，SeMet為0.066 mg/kg。

圖6 實際樣品的檢測結果Fig. 6 Chromatogram of real sample

3 結 論

采用HPLC-ICP-MS測定富硒茶葉中5 種硒化合物，通過對色譜分離條件和樣品前處理方法的優化，利用高效液相色譜Hamilton PRP-X100色譜柱分析5 種硒化合物，線性范圍為0～50 μg/L，線性相關系數不小于0.999 8，檢出限為0.13～1.09 μg/L，5 種硒化合物的回收率在91.8%～109.4%之間，5 種硒化合物的相對標準偏差均在5%以內。本方法樣品前處理簡便快速、檢出限低、精密度高、重復性好，能有效地同時處理和分析5 種硒化合物，適用于富硒茶葉中5 種硒化合物的測定。

參考文獻：

[1] ESCUDERO L A, PACHECO P H, GASQUEZ J A, et al.Development of a FI-HG-ICP-OES solid phase preconcentration systemfor inorganic selenium speciation in Argentinean beverages[J]. Food Chemistry, 2015, 169(1): 73-75. DOI:10.1016/j.foodchem.2014.07.127.

[2] BRYSZEWSKA M A, MAGE A. Determination of selenium and its compounds in marine organisms[J]. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 2015, 29(1): 91-98. DOI:10.1016/j.jtemb.2014.10.004.

[3] BIRD S M, GE H, UDEN P C, et al. High-performance liquid chromatography of selenoamino acids andorgano selenium compounds speciation by inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A, 1997, 789(1/2): 349-359.

[4] WHANGER P D J. Metabolism of selenium in humans[J]. The Journal of Trace Elements in Experimental Medicine, 1998, 11(2/3): 227-240.

[5] MAZEJ D, FALNOGA I, VEBER M, et al. Determination of selenium species in plant leaves by HPLC-UV-HG-AFS[J]. Talanta, 2006,68(3): 558-568. DOI:10.1016/j.talanta.2005.04.056.

[6] 楊玉玲, 劉元英. 食品中硒的測定和形態分析進展[J]. 中國調味品,2013, 38(6): 1-5. DOI:10.3969/j.issn.1000-9973.2013.06.001.

[7] 李紅英, 陳永波, 胡百順, 等. 原子熒光和電感耦合等離子質譜法在硒形態分析中的應用[J]. 氨基酸和生物資源, 2014, 36(2): 39-43.

[8] 劉揚, 張濤, 楊靜, 等. 運用RPLC-ICP-MS對富硒酵母中的硒形態分析[J]. 食品與生物技術學報, 2013, 32(12): 1261-1265.

[9] 謝娟平. 紫陽富硒茶中硒的賦存形態及浸出率研究[J]. 食品研究與開發, 2016, 37(9): 156-159. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.036.

[10] 方建軍, 祝華明, 方芳, 等. 富硒大米中硒形態分析[J]. 食品研究與開發, 2012, 33(9): 146-149.

[11] BUENO M, PANNIER F. Quantitative analysis of volatile selenium metabolites in normal urine by headspace solid phase microextraction gas chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry[J].Talanta, 2009, 78(3): 759-763. DOI:10.1016/j.talanta.2008.12.044.

[12] MONTES-BAYóN M, MOLET M J D, GONZáLEZ E B, et al.Evaluation of different sample extraction strategies for selenium determination in selenium-enriched plants (Allium sativum and Brassica juncea) and Se speciation by HPLC-ICP-MS[J]. Talanta,2006, 68(4): 1287-1293. DOI:10.1016/j.talanta.2005.07.040.

[13] 謝小雪, 葉明德, 陳丹飛, 等. 離子交換色譜-氫化物原子熒光法測定水產品中硒的形態[J]. 分析試驗室, 2014, 33(2): 231-243.DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2014.0054.

[14] DENG B Y, SHEN C Y, QIN X D, et al. Selenium speciation in ginger using capillary electrophoresis online coupled with electrothermal atomic absorption spectrometry[J]. Journal of Analytical Atomic Spectrometry, 2014, 29(10): 1889-1896. DOI:10.1039/c4ja00129j.

[15] YAN L Z, DENG B Y, SHEN C Y, et al. Selenium speciation using capillary electrophoresis coupled with modified electrothermal atomic absorption spectrometry after selective extraction with 5-sulfosalicylic acid functionalized magnetic nanoparticles[J]. Journal of Chromatography A, 2015, 1395(1): 173-179. DOI:10.1016/j.chroma.2015.03.061.

[16] KOCOT K, LEARDI R, WALCZAK B, et al. Determination and speciation of trace and ultratrace selenium ions by energy-dispersive X-ray fluorescence spectrometry using grapheme as solid adsorbent in dispersive micro-solid phase extraction[J]. Talanta, 2015, 134(1): 360-365. DOI:10.1016/j.talanta.2014.11.036.

[17] 肖志明, 宋榮, 賈錚, 等. 液相色譜-氫化物發生原子熒光光譜法測定富硒酵母中硒的形態[J]. 分析化學研究報告, 2014, 42(9): 1314-1319. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.140390.

[18] 謝倩, 李建洪, 黃文耀, 等. HPLC-ICP-MS測定硒蛋白中硒代氨基酸的方法[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2015, 25(5): 636-641.

[19] MAR J L, REYES L H, RAHMAN G M, et al. Simultaneous extraction of arsenic and selenium species from rice products by microwave-assisted enzymatic extraction and analysis by ion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(8): 3005-3013. DOI:10.1021/jf803598k.

[20] 李晶, 孔維恒, 高峰, 等. HPLC-ICP-MS法分析測定富硒保健品中的硒形態[J]. 現代儀器, 2012, 18(3): 36-39.

[21] MCSHEEHY S, YANG W J, PANNIER F, et al. Speciation analysis of selenium in garlic by two-dimensional high-performance liquid chromatography with parallel inductively coupled plasma mass spectrometric and electrospray tandem mass spectrometric detection[J].Analytica Chimica Acta, 2000, 421(1): 147-153.

[22] 吳雅穎, 桂仁意, 湯鋆, 等. HPLC-ICP-MS聯用技術測定竹筍中六種硒形態[J]. 營養學報, 2014, 36(5): 494-498. DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr.sin.2014.05.018.

[23] KAMMAMKUMARAH S S, WRBEL K, WUILLOUD R G, et al.Studying the distribution pattern of selenium in nut proteins with information obtained from SEC-UV-ICP-MS and CE-ICP-MS[J].Talanta, 2005, 66(1): 153-159. DOI:10.1016/j.talanta.2004.10.010.

[24] 王丙濤, 謝麗琪, 林燕奎, 等. 高效液相色譜-電感耦合等離子質譜聯用檢測食品中的五種硒形態[J]. 色譜, 2011, 29(3): 223-227.DOI:10.3724/SP.J.1123.2011.00223.

[25] CROCHFORD D, HOLMES E, LINDON J C, et al. Statistical heterospectroscopy, an approach to the integrated analysis of NMR and UPLC-MS data sets: application in metabonomic toxicology studies[J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(2): 363-371. DOI:10.1021/ac051444m.

[26] 李登科, 范國樑, 葉鴻宇, 等. 高效液相色譜-電感耦合等離子質譜分析煙草中硒形態[J]. 分析科學學報, 2016, 32(6): 836-840.DOI:10.13526/j.issn.1006-6144.2016.06.019.

[27] FRANCESCONI K A, SPRLING M. Speciation analysis with HPLC-mass spectrometry: time to take stock[J]. Analyst, 2005, 130(7):998-1001.

[28] 米秀博, 邵樹勛, 湯鋆, 等. 湖北恩施地區天然富硒植物中硒形態的HPLC-ICP-MS分析[J]. 草業科學, 2014, 31(6): 1173-1177.DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2013-0436.

[29] 王欣, 幸苑娜, 陳澤勇, 等. 高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法檢測富硒食品中6 種硒形態[J]. 分析化學研究報告, 2013, 41(11):1669-1674. DOI:10.3724/sp.j.1096.2013.30491.

[30] 曹玉嬪, 閆麗珍, 黃紅麗, 等. 超聲輔助提取結合高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用技術測定牛蒡和三七中硒形態[J]. 分析化學, 2015, 43(9): 1329-1334. DOI:10.11895/j.issn.0253-3820.150574.