直接進樣串聯質譜法快速篩查水產副產物中ω-3脂肪酸鏈磷脂

崔益瑋，俞喜娜，李詩言，戴志遠，陳 康，沈 清,*

（1.浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗室，浙江 杭州 310012；3.浙江省水產質量檢測中心，浙江 杭州 310023）

水產品中富含一種特殊的含長鏈多烯脂肪酸的磷脂，其sn-2位置連接一條ω-3多不飽和脂肪酸鏈，主要包括二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳五烯酸（docosapentenoic acid，DPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等。ω-3脂肪酸是人體不可缺少但自身又不能合成的重要營養元素，因此被稱為人體必需脂肪酸。已有研究表明，含ω-3脂肪酸鏈磷脂在消化吸收、穩定性及生物利用度等活性方面優于傳統ω-3脂肪酸鏈甘油酯型產品[1]。

ω-3脂肪酸鏈磷脂不僅具有磷脂的生理功能，還具有ω-3多不飽和脂肪酸的生理功能。醫學和營養學研究表明ω-3多不飽和脂肪酸對心腦血管疾病、肺病、腎病、2型糖尿病、高血壓、大腸潰瘍和節段性回腸炎的治療都會起到積極的作用[2-4]。其中EPA具有抑制血小板凝聚、抗血栓、舒張血管、調整血脂等治療和預防心腦血管病的功能，EPA過氧化物和自由基可抑制腫瘤細胞表達，縮短染色體的端粒，促進腫瘤細胞的凋亡[5-6]；DPA只存在于少數海洋哺乳動物油脂中，它對神經細胞的發育、遞質傳導、促視神經生長、改善視力、防治癌癥等具有重要作用，還可以抑制血小板凝集，增強內皮細胞遷移能力[7-8]，其調節血脂的功能優于EPA[9]。DHA具有調降三高健康心血管，健腦益智提高記憶力，增強視網膜反射能力以及防治老年性癡呆，以及抗癌、抗炎、抗氧化等提高生命質量的功能[10-12]。因此，提取分離高純度ω-3脂肪酸鏈磷脂已成為發達國家竟相研究的熱點。然而天然形式的ω-3脂肪酸鏈磷脂通常含量較低，且其來源十分有限，商業上EPA、DPA及DHA磷脂的來源主要是脂肪含量高的海洋魚類[13]。隨著海況的變化和海上捕撈強度的不斷增加，海上漁業資源結構發生了重大變化，環境污染、過度捕撈等因素造成資源短缺，促使人們積極尋找開發富含EPA、DPA及DHA磷脂的新資源。

目前ω-3脂肪酸鏈磷脂的相關檢測方法主要以液相色譜-串聯質譜法為主，該方法根據不同色譜柱分離模式與質譜掃描模式檢測磷脂分子結構與含量[14-18]。成琳等[19]建立測定豆醬中活性成分磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）與其降解產物溶血磷脂酰膽堿和甘油磷脂酰膽堿含量的超高效液相色譜-質譜聯用分析方法，此方法準確、靈敏度高、樣品處理簡單、分析時間短。王斌等[20]建立了保健膠囊中PC的超高效液相色譜-質譜/質譜確證方法，適用于保健膠囊中PC的檢測和確證。Shen Qing等[21-23]成功采用基質輔助激光解吸飛行時間質譜建立了橄欖、杏仁、牛油果的脂質組學快速分析方法。目前報道的方法均為定向篩選法，且分析耗時較長。

本研究擬利用質譜直接進樣法建立快速篩查含ω-3脂肪酸鏈磷脂的方法，快速掃描復雜樣品中含有EPA、DPA及DHA脂肪酸鏈的磷脂并進行結構鑒定和相對含量測定，有利于快速篩選ω-3脂肪酸鏈磷脂原料資源，促進ω-3脂肪酸鏈磷脂保健品產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水產加工鮐魚副產物由舟山奧旭魚油制品有限公司提供。

PC、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanoamine，PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）和磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）標準品（純度97%）美國Avanti Polar Lipids公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

4000 QTRAP串聯四極桿質譜儀（配有電噴霧離子源及Analyst1.5數據處理系統） 美國AB Sciex公司；針泵注射進樣器 美國Harvard公司；落地式高速冷凍離心機 美國Thermo公司；超純水系統 法國Milli-Q公司。

1.3 方法

1.3.1 脂質提取

稱取10 g水產加工副產物洗凈后研磨成漿，準確稱取0.1 g糜液，并用二氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）混合液3 mL冰浴超聲提取30 min，提取完畢后加入純水3 mL并用冷凍離心機于4 ℃、8 000 r/min離心15 min；使用移液槍移取下相溶液，向上清液和殘渣中加入2 mL二氯甲烷重復上述操作提取2次；將所有提取后所得的下相溶液合并，用氮氣進行低溫吹干后得脂質粗提物。將粗提物用5 mL甲醇復溶，過0.22 μm濾膜后待用。

1.3.2 質譜條件

采用負離子模式下母離子掃描（precursor ion scan，PreIS），通過多通道檢測累加計算譜圖；離子噴霧電壓：4.5 kV；離子源溫度：450 ℃；去簇電壓：－100 V；碰撞電壓：－40 V；掃描范圍：350～1 150 Da；駐留時間：2 s；氣簾氣壓力：10 psi；輔助氣壓力：30 psi；針泵注射進樣器流速：5 μL/min。以PreIS分別掃描m/z 301、329和327特征碎片離子峰，得到所有含有EPA、DPA及DHA脂肪酸鏈的磷脂。同1 d內對同一樣品平行提取檢測5 份并計算日內相對標準偏差，同一樣品連續7 d，每天各提取檢測一次并計算日間相對標準偏差。

1.4 數據處理

質譜數據采集使用Analyst軟件；將譜圖經過最低峰寬為0.2 Da噪音過濾，基線扣除4 Da，去同位素峰后得到譜圖，將譜圖導出為txt文件；磷脂分子通過LipidView 1.1（美國AB Sciex公司）搜庫鑒定，部分低豐度脂質使用Lipid Mass Spec. Prediction軟件鑒定，得到各個離子峰的結構信息；相對豐度的計算公式為：

式中：Ai為該化合物峰面積；1，2，3……n表示譜圖中的各個化合物的峰面積。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化

圖1 含ω-3脂肪酸鏈磷脂結構式Fig. 1 Structure of phospholipids with ω-3 fatty acid chains

PreIS是一種根據化合物共有碎片離子峰，掃描含有該碎片離子峰的所有化合物母離子。PreIS是三重四極桿串聯質譜的一種重要模式，但是相關方法開發與應用報道非常少[24-25]。本研究以EPA、DPA及DHA脂肪酸鏈為特征碎片離子峰（圖1），進而以PreIS分別掃描所有含有這3 種脂肪酸鏈的磷脂，實現直接進樣快速篩選優質磷脂資源的目的[26-28]。動物組織中磷脂主要包括PC、PE、PI、PS等，其中PC和PE是細胞磷脂雙分子層的主要成分，磷脂酰甘油和甘油磷脂酸均屬低豐度磷脂，通常檢出量較少[29]。除了PC以外磷脂均易在負離子模式下電離形成[M－H]－。PC由于膽堿較易質子化，在正離子模式下離子峰強度相對較強，其負離子模式下電離形成[M＋Cl]－也能被順利檢測到[30]。因此，本實驗采用負離子模式監測水產品副產物中的磷脂。去簇電壓和碰撞電壓是影響磷脂信號強度最顯著的因素，通過選定特征碎片進行PreIS掃描爬坡測試，得到最佳參數為去簇電壓－100 V和碰撞電壓－40 V。磷脂的基本結構由極性基團和脂肪酸鏈構成，其中單條脂肪酸鏈的碳原子數在14～22之間，考慮到溶血性磷脂，質譜掃描范圍設定為350～1 150 Da。

2.2 EPA鏈磷脂

圖2 水產副產物中含EPA鏈磷脂質譜圖Fig. 2 Mass spectrum of EPA containing phospholipids in aquatic byproducts

含EPA鏈磷脂在質譜真空環境下經碰撞誘導解離，其sn-2位置的EPA鏈斷裂并生成碎片離子m/z 301，因此選定該碎片為特征離子進行PreIS掃描，樣品經針泵直接進樣后進行數據采集得到圖2。含EPA鏈磷脂質譜圖特征較為明顯，共鑒定磷脂分子17 種，其中最大峰m/z 814.9相對強度23.2%，經搜庫鑒定其結構可能為[PC 16:0/20:5＋Cl]－、[PE 22:3/20:5－H]－或兩者的重疊，其后依次為m/z 736.8、764.8、816.9、762.8，結構分別為[PE 16:0/20:5－H]－、[PE 18:0/20:5－H]－、[PE 22:2/20:5－H]－和[PE 18:1/20:5－H]－，其余離子峰強度相對較弱，經結構鑒定結果見表1。根據水產品副產物中含EPA鏈磷脂結構特征表明，其sn-1位置的脂肪酸鏈主要以C16:0、C18:1和C18∶0為主。此外還檢測到了2 條脂肪酸鏈均為EPA結構的磷脂，如PS 20:5/20:5（m/z 826.9）；同時含DPA和EPA鏈結構的磷脂，如PI 22:5/20:5（m/z 841.9），以及溶血性磷脂lysoPC 20:5（m/z 577.1）。

表1 水產副產物中EPA鏈磷脂相對豐度和分子結構Table 1 Relative abundances and chemical structures of EPA containing phospholipids in aquatic byproducts

2.3 DPA鏈磷脂

含DPA鏈磷脂經碰撞誘導解離，其sn-2位置的DPA鏈斷裂并生成碎片離子m/z 329，因此選定該碎片為特征離子進行PreIS掃描得圖3。含DPA鏈磷脂分子種類多樣，共鑒定磷脂分子17 種，其推測結構和相對含量見表2，其中m/z 791.0（[PE 18:1/22:5－H]－）和m/z 842.8（[PC 16:0/22:5－H]－）為信號相對最強的磷脂分子，分別為18.7%和16.1%。水產品副產物中含DPA鏈磷脂的sn-1位置的脂肪酸鏈除C16:0、C18:1和C18:0結構外，C20:1和C22:2信號也較強，如m/z 818.9（[PE 20:1/22:5－H]－）和m/z 844.8（[PE 22:2/22:5－H]－）。水產品副產物中DPA鏈磷脂分子種類豐富，且較傳統的游離型、乙酯型和甘油三酯型DPA在消化吸收以及營養功效方面更加優越。因此，以水產品加工副產物為原料開發ω-3脂肪酸鏈磷脂保健功能產品潛力較大。

圖3 水產副產物中含DPA鏈磷脂質譜圖Fig. 3 Mass spectrum of DPA containing phospholipids in aquatic byproducts

表2 水產副產物中DPA鏈磷脂相對豐度和分子結構Table 2 Relative abundances and chemical structures of DPA containing phospholipids in aquatic byproducts

2.4 DHA鏈磷脂

本方法在檢測DHA鏈磷脂方面不同于目前常用的自上而下篩選法，即先鑒定所有磷脂分子結構，再從其中篩選含DHA鏈磷脂，而是采用自下而上的策略，即特異性篩查含DHA鏈磷脂，自動過濾非目標化合物。含DHA鏈磷脂經碰撞誘導解離，其sn-2位置的DHA鏈斷裂并生成碎片離子m/z 327，因此選定該碎片為特征離子進行PreIS掃描得圖4。離子峰m/z 840.9信號最強，相對豐度為20.8%，其結構鑒定為[PC 16:0/22:6－H]－和[PE 22:2/22:6－H]－。其后依次為m/z 788.9（14.5%）、m/z 790.9（11.1%）和m/z 866.8（9.6%），結構分別為[PE 18:1/22:6－H]－、[PE 18:0/22:6－H]－和[PC 18:1/22:6－H]－，其余離子峰強度相對較弱，經鑒定結果見表3。水產品加工副產物中DHA磷脂種類豐富，共鑒定16 種磷脂分子，部分磷脂不飽和度極高，如PS 20:5/22:6和PI 22:6/22:6，相對豐度分別為1.9%和3.6%。DHA是人體無法自身合成具有重要保健功能的脂質，本方法可一步快速篩查樣品中含DHA鏈磷脂，為探索與發現磷脂新資源提供重要支持。

圖4 水產副產物中含DHA鏈磷脂質譜圖Fig. 4 Mass spectrum of DHA containing phospholipids in aquatic byproducts

表3 水產副產物中DHA鏈磷脂相對豐度和分子結構Table 3 Relative abundances and chemical structures of DHA containing phospholipids in aquatic byproducts

2.5 方法重復性實驗結果

本實驗針對每類ω-3脂肪酸磷脂選取高低豐度各兩種磷脂分子，EPA磷脂（m/z 814.9、736.8、765.8和767.8）、DPA磷脂（m/z 790.0、842.9、793.9和816.8）、DHA磷脂（m/z 840.8、788.9、763.6和854.8），通過同1 d內對同一樣品平行提取檢測5 份以及同一樣品連續7 d每天各提取檢測一次的方式，計算日內及日間相對標準偏差，見表4。結果表明，所有磷脂分子相對標準偏差不高于7.3%，PreIS模式下質譜數據穩定性較好。

m/z EPA DPA DHA 814.9736.8765.8767.8 790.0842.9793.9816.8 840..8788.9763.6854.8相對標準 日內 4.6 4.3 4.2 3.7 3.9 3.6 4.1 3.8 3.2 2.8 2.4 3.3偏差/% 日間 7.3 7.1 6.9 6.5 6.5 6.3 7.0 6.4 6.1 5.9 5.5 6.1項目

3 結 論

ω-3脂肪酸鏈磷脂不僅具有磷脂的生理功能，還具有ω-3多不飽和脂肪酸的生理功能，比傳統的游離型和甘油三酯型ω-3脂肪酸在消化吸收和營養功效方面更佳。目前含EPA、DPA和DHA鏈磷脂的檢測方法均為自上而下篩選法，即先鑒定所有磷脂分子結構，再從其中篩選目標磷脂。本方法采用針泵注射進樣，以m/z 301、329和327為特征碎片離子峰掃描含EPA、DPA和DHA鏈磷脂質譜全譜圖，譜圖內離子峰均為目標磷脂，無雜質峰干擾。該方法可大大簡化后期數據處理與鑒定分析，方法穩定可靠，為快速篩查ω-3脂肪酸鏈磷脂資源提供重要技術手段。

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