響應面試驗優化產琥珀酸放線桿菌GXAS137發酵粗甘油產丁二酸工藝

張紅巖，朱 婧，馮 英,3，李 億，秦 艷，王青艷，梁 戈，申乃坤,4,*

丁二酸（又名琥珀酸），是一種重要的四碳平臺化合物，可以取代苯合成包括四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、γ-丁內酯、1,4-丁二醇、己二酸等在內的250 種以上專用化學品或大宗化學品，可廣泛應用于食品、塑料、醫藥、香料等工業[1]。此外，丁二酸還是合成可降解塑料的主要原料，它可以與丁二醇、乙二醇、丙二醇等縮合聚合生產聚丁二酸丁二醇酯、聚乙二醇丁二酸酯、聚丙二醇丁二酸酯等具有優良特性且可完全被生物降解的高分子材料，是丁二酸潛在的最具發展前景的領域[2]。美國能源部2004年公布的12 種最有潛力大宗產品中，丁二酸排在第一位[3]。目前商品化的丁二酸的主要是以順丁烯二酸、順丁烯二酸酐等石油基材料為原料通過催化加氫或電化學合成，其過程中伴隨大量溫室氣體及有毒廢棄物的排放，對環境污染嚴重。隨著石油資源供應日益緊張以及環境意識的日益增強，化學法合成逐漸受到限制，不利于丁二酸相關產業的發展。而微生物發酵法生產丁二酸具有以可再生的生物質資源為原料、發酵條件溫和、可固定CO2等一系列優點，成為近年來國內外的研究熱點之一[4-5]。在眾多產丁二酸的微生物中，產琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）以其產量高（最高可達110 g/L）、耐受性強（最高可耐160 g/L葡萄糖）等優點，是目前最具發展前景的生產菌種之一[6]。但目前微生物發酵法生產丁二酸的生產成本偏高，影響了其產業化的進程。采用廉價或廢棄的非糧生物質資源替代葡萄糖進行丁二酸生產，不僅是對廢棄的生物質資源再利用，而且可以有效降低丁二酸生產原料成本，對促進丁二酸生物發酵法生產具有重要的意義[7]。國內外學者對乳清[8]、甘蔗汁[9]、糖蜜[10]、面包加工廢料[11]及農業廢棄物[12-13]等原料發酵生產丁二酸進行了研究，取得了較好的效果，丁二酸生產成本明顯下降。但與化學合成法相比，生產成本仍然偏高，需要進一步探索更為低廉的原料進行丁二酸生產。

甘油是作為酒精發酵和油脂皂化反應中的副產物被發現的，在生物柴油的制備過程中，每生產9 t生物柴油就會副產約1 t粗甘油[14]。伴隨生物柴油規模的不斷增大，粗甘油產量也會相應提高。粗甘油在制備過程中帶入了鹽類、甲醇、皂等雜質，只有經過進一步的純化和精制后才能在醫藥、化妝品和食品等領域使用，但粗甘油純化精制成本較高，在經濟上不可行，導致目前粗甘油價格急劇下跌，幾乎成了工業的廢棄物，若不及時處理，有可能會成為一種新的污染源[15]，進而增加了生物柴油生產企業的處理成本，降低了經濟效益。利用生物技術將粗甘油作為底物轉化為高價格的產品引起了越來越多研究者的關注[16]。當前甘油利用的有效途徑包括：發酵生產1,3-丙二醇、乙醇、3-羥基丙酸等；制備環氧氯丙烷、乙二醇二羥基丙酮等[17]。但利用微生物將甘油轉化為丁二酸的研究較少，尚處于起步階段[18-19]。與葡萄糖發酵產丁二酸相比，粗甘油不僅價格低廉，而且還原性更強，發酵過程中產生的還原力是葡萄糖的兩倍[20]。但目前甘油發酵產丁二酸的產量較低，批次發酵最高只有29.3 g/L[18]，遠低于葡萄糖發酵水平（110 g/L[6]），需要對發酵工藝進一步優化。而國內有關粗甘油發酵產丁二酸的研究目前還鮮見報道。

本研究對實驗室前期篩選到的產琥珀酸放線桿菌GXAS137發酵粗甘油產丁二酸的培養基進行了優化，先利用單因素試驗對影響發酵的主要因素進行優化，再利用響應面試驗對篩選出的關鍵因素的濃度進行進一步優化，提高丁二酸產量，降低生產成本。與葡萄糖發酵產丁二酸相比，粗甘油不僅能夠降低生產成本，而且還實現了廢物資源的有效利用，提高其經濟附加值，在資源的有效利用及環境保護方面均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

粗甘油購自南京長江江宇油脂有限公司，其甘油質量分數約為85%，其他雜質（水、部分聚甘油等）質量分數約為15%。

1.1.2 菌種與培養基

產琥珀酸放線桿菌GXAS137[9]為本實驗室選育獲得，保藏號為：CCTCCM 2011399。

種子培養基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，玉米漿5 g/L，NaCl 2 g/L，NaH2PO4·2H2O 8.5 g/L，K2HPO415.5 g/L，NaHCO32 g/L，半胱氨酸鹽酸鹽1 g/L，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

原始甘油發酵培養基：粗甘油30 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgCl2·6H2O 0.5 g/L，CaCl20.5 g/L，MgCO330 g/L，115 ℃條件下滅菌20 min。

1.1.3 試劑

酵母提取物、蛋白胨 英國Oxoid公司；葡萄糖、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀 生物工程（上海）股份有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設備

DG250小型厭氧工作站 英國Don Whitley Scientific公司；U-3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國戴安公司；色譜柱Rezex ROA-Organic Acid H＋（8%）（300 mm×7.8 mm） 美國菲羅門公司。

1.3 方法

1.3.1 培養與發酵條件

種子培養：將甘油保藏的菌種接種到液體種子培養基進行活化，37 ℃培養15 h后，按照5%接種量（體積分數，下同）接種于裝有95 mL種子三角搖瓶（容積為250 mL）中，37 ℃培養8 h，可得到成熟種子。

發酵過程：按8%接種量接種于裝有92 mL發酵培養基的三角搖瓶中進行發酵，置37 ℃發酵72 h進行產物分析。

1.3.2 樣品分析測定[9]

1.3.2.1 樣品預處理

樣品在轉速為12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液進行適當稀釋，然后用0.22 μm孔徑的無菌濾膜過濾后，HPLC檢測發酵液丁二酸、乙酸、甲酸及殘甘油質量濃度。

1.3.2.2 有機酸含量測定

采用HPLC法，自動進樣器，流動相為2.5 mmol/L H2SO4溶液（pH 2.5），流速0.6 mL/min，柱溫45 ℃，自動進樣器進樣，進樣量10 μL，紫外檢測器的波長為210 nm。

1.3.2.3 甘油含量測定

采用HPLC法，紫外檢測器與示差檢測器聯用，示差檢測器的溫度為50 ℃。

1.3.3 粗甘油發酵產丁二酸條件優化

1.3.3.1 單因素試驗

在前期實驗的基礎上[9-10]，對粗甘油發酵產丁二酸條件進行了預實驗，發現碳源、氮源及電子受體對丁二酸產量影響較大，需要進一步進行優化。在粗甘油質量濃度為30 g/L時，考察不同電子受體對甘油發酵產丁二酸的影響；在確定電子受體情況下，考察粗甘油質量濃度對丁二酸發酵的影響；在確定電子受體及粗甘油質量濃度時，考察不同種類的氮源對丁二酸產量的影響，以期篩選出合適廉價氮源，以替代價格昂貴的酵母提取物。

1.3.3.2 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，借助響應面試驗設計Design-Expert 8.0軟件的Box-Behnken設計原理，以丁二酸產量考察指標，對粗甘油、電子受體二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）及玉米漿質量濃度這3 個顯著性影響因素各取低（－1）、原點（0）、高（1）三水平進行響應面優化試驗，各個因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in central composite design

1.4 數據處理

實驗數據取3 次平均值；圖表采用Origin 8.0及Excel 2007進行處理繪制，響應面試驗設計與分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同電子受體對甘油發酵產丁二酸的影響

微生物代謝甘油過程中為了維持氧化還原電位平衡，一部分被還原成1,3-丙二醇排除細胞外，另一部分被氧化成磷酸二羥丙酮進入糖酵解途徑。但產琥珀酸放線桿菌的代謝通路中缺少1,3-丙二醇代謝途徑，所以代謝過程中電子受體供應不足，在以甘油為碳源培養基中生長較差，只有在外源添加電子受體的情況下才能實現FAD＋的再生[18]。所以本研究在初始發酵培養基的基礎上，分別添加10 g/L亞甲基藍、DMSO、乙偶姻、二羥基丙酮、亞硝酸鈉為電子受體進行丁二酸生產。37 ℃條件下發酵72 h，HPLC分析測定樣品，每組設3 個平行，結果取平均值（下同）。

圖1 不同電子受體對粗甘油發酵產丁二酸的影響Fig. 1 Effect of different electron acceptors on the production of succinic acid

從圖1可知，產琥珀酸放線桿菌GXAS137可以利用粗甘油發酵產丁二酸，丁二酸為主要產物，主要副產物為乙酸和甲酸。但不添加任何電子受體時，丁二酸產量較低，只有4.76 g/L，而且菌體生長較差，這與文獻報道的產琥珀酸放線桿菌CGMCC 1593[20]及NJ 113[21]不能利用甘油不同，這可能是不同菌株的代謝差異造成的。當添加DMSO為電子受體時，丁二酸產量最高，可達16.88 g/L；而添加其他電子受體丁二酸產量高于對照組，但低于DMSO組。因此，DMSO為粗甘油發酵產丁二酸合的最適電子受體。這可能是由于外源添加DMSO有利于維持細胞的氧化還原平衡（FAD＋/FADH2），實現細胞體內輔酶的再生，從而增加了丁二酸產量[19]。

2.2 粗甘油質量濃度對丁二酸產量的影響

碳源含量對產琥珀酸放線桿菌生長和丁二酸合成影響極大，碳源含量較低時，不利于丁二酸高濃度生產[22]；但碳源含量過高時會抑制菌體生長及丁二酸合成。Urbance等[23]研究表明，當葡萄糖為碳源時，70 g/L或者更高質量濃度的葡萄糖會抑制產琥珀酸放線桿菌生長，這一結論得到大多數學者驗證[24-25]。為了研究粗甘油質量濃度對丁二酸產量的影響，在初始發酵培養基（不含碳源）的基礎上，分別添加粗甘油質量濃度為30、40、50、60、70 g/L，并添加10 g/L的DMSO作為電子受體，考察粗甘油質量濃度對丁二酸產量的影響，結果見圖2。

圖2 粗甘油質量濃度對粗甘油發酵產丁二酸的影響Fig. 2 Effect of crude glycerol concentration on the production of succinic acid

從圖2可以看出，當粗甘油質量濃度低于50 g/L時，丁二酸隨著粗甘油質量濃度的增加而升高；而當質量濃度超過50 g/L時，丁二酸產量會隨粗甘油質量濃度增加而降低；當粗甘油質量濃度為70 g/L，丁二酸的合成受到嚴重抑制，產量只有16.21 g/L。因此，粗甘油最適質量濃度為50 g/L，此時丁二酸產量最高，達到32.06 g/L。粗甘油發酵產丁二酸的最適質量濃度遠低于葡萄糖（70～75 g/L）[10,12]，這可能與粗甘油的滲透壓較高且含有甲醇、鹽類等有害成分有關。

2.3 氮源種類及質量濃度對丁二酸產量的影響

氮源是構成微生物菌體和一些代謝產物的必需營養元素，產琥珀酸放線桿菌本身不能合成生物素、煙酸、甲硫氨酸等生長因素[26]，需要添加合適的氮源來提供生長所需的氨基酸和維生素等生長因素，因此，對氮源的要求較高。前人研究表明酵母提取物為氮源時，丁二酸產量遠高于其他氮源[12,25]。但酵母提取物的價格較高，會顯著增加生產成本，嚴重阻礙丁二酸大規模工業化生產，需要積極探索其他價格低廉的替代氮源。因此，以50 g/L的粗甘油為碳源，分別添加酵母粉（總氮質量分數12.5%）8 g/L、蛋白胨（總氮質量分數12.7%）7.87 g/L、牛肉膏（總氮質量分數13.1%）7.63 g/L、玉米漿（總氮質量分數7.4%）13.51 g/L、硫酸銨（總氮質量分數21%）4.76 g/L作為氮源，設定添加總氮終質量濃度為1.0 g/L，對照組不加入任何氮源，考察不同種類的氮源對粗甘油發酵產丁二酸的影響。發酵72 h后，分析測定樣品，結果見圖3。

圖3 不同氮源對粗甘油發酵產丁二酸的影響Fig. 3 Effect of different nitrogen sources on the production of succinic acid

從圖3可以看出，酵母提取物為粗甘油發酵產丁二酸的最適氮源，此時，丁二酸產量為32.13 g/L，其次為玉米漿，丁二酸產量達到30.24 g/L；蛋白胨及牛肉膏為氮源時，丁二酸產量分別為22.35 g/L和24.61 g/L；而空白對照及硫酸銨為氮源時幾乎無丁二酸產生。

圖4 玉米漿質量濃度對粗甘油發酵產丁二酸的影響Fig. 4 Effect of corn steep liquor concentration on the production of succinic acid

通過進一步對玉米漿質量濃度進一步優化（圖4），當玉米漿質量濃度為16 g/L時，丁二酸產量達到32.06 g/L，幾乎與酵母提取物為氮源時的丁二酸產量相當，這可能與玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、生長素和一些前體物質，能滿足產琥珀酸放線桿菌的生長、發酵[10]。而玉米漿價格（國產約2 500 元/t）遠低于酵母提取物（國產約5 000 元/t），可顯著降低丁二酸生產成本。因此，選擇玉米漿作為粗甘油發酵產丁二酸的氮源。

2.4 響應面試驗結果

2.4.1 響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗確定的3 個因素，利用Box-Behnken試驗設計三因素三水平共15 個試驗點進行響應面分析。析因點共12 個，用于考察3 個變量在3 個不同水平下對丁二酸產量的影響；零點為區域的中心點，重復3 次（試驗號1、4、15），用于估計試驗的誤差。結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with response variable

2.4.2 模型方程的建立與顯著性檢驗

根據表2的試驗結果，利用Design-Expert 8.0對丁二酸產量Y值與各因素進行多元回歸分析，同時擬合得二次回歸方程：

方程的決定系數R2為0.994 0，說明該回歸方程的擬合度很好，可以通過該回歸方程對實際試驗結果進行分析。進一步對響應面試驗方差進行分析，結果見表3。

表3 Box-Behnken試驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

由表3可知，模型P＜0.0001，達到極顯著水平，說明該試驗模型顯著；決定系數R2等于0.994 0，說明建立的該模型能解釋99%響應值的變化；復合相關系數R為0.983 2，說明該模型擬合程度良好，失擬項不顯著（P＞0.05）。以上分析表明模型擬合度較好，試驗誤差較小，模型的預測值能與實際試驗值間具有高度相關度[14]。

由表3回歸模型系數顯著性檢驗結果可知：因素一次項X1、X3對丁二酸的產量影響極顯著（P＜0.01），X2影響顯著（P＜0.05）；交互項X1X3影響顯著（P＜0.05），X1X2、X2X3影響不顯著（P＞0.05)；二次項X12、X22、X32對丁二酸產量影響極顯著（P＜0.01）；這表明試驗各因素與響應值之間不是簡單的線性關系[27]。各因素對丁二酸產量的影響程度為：X1＞X3＞X2，即粗甘油質量濃度＞玉米漿質量濃度＞DMSO質量濃度。

2.4.3 響應面分析

響應面是各因素對響應值影響對所構成的三維空間曲面圖，它可以直觀反映出各個因素與響應值的交互作用，提供一種形象的觀測響應值和試驗參數水平關系的方法[28]。曲面越陡峭，說明因素對響應值影響越大。響應面中各因素的等高線形狀可以反映因素間交互作用的顯著程度。如等高線的性狀為橢圓形，表明兩因素交互作用顯著；但如果等高線性狀為圓形，則表明兩因素的交互作用不顯著[29]。通過對上述多元回歸方程作響應面及等高線圖，結果見圖5。

圖5 各因素交互作用對丁二酸產量影響的響應面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour pots showing the interactive effects of variables on succinic acid yield

由圖5可知，各因素對響應面的陡峭程度的影響為：粗甘油質量濃度＞玉米漿質量濃度＞DMSO質量濃度，這說明粗甘油對丁二酸產量影響最大，其次為玉米漿，DMSO影響最小，這與方差分析結果一致。從等高線圖可知，因素粗甘油與DMSO質量濃度及DMSO與玉米漿質量濃度間的等高線為圓形，因素的交互影響不顯著；而粗甘油與玉米漿質量濃度的等高線為橢圓形，沿粗甘油方向峰值移動的等高線密度明顯大于玉米漿方向，這說明粗甘油與玉米漿見有交互影響，且粗甘油對丁二酸產量影響較大。

2.4.4 模型最高點預測及驗證實驗結果

對獲得的模型中影響不顯著的因素X1X2、X2X3去除，運用軟件Design-Expert 8.0重新構建模型，并對方程的最大值進行求解，得到響應面的最高點。最佳點時X1、X2、X3的值分別為0.543、0.176、0.689，對應各因素的實際值分別為粗甘油55.43 g/L、DMSO 10.35 g/L、玉米漿17.69 g/L，此點丁二酸產量為37.11 g/L。

為了檢驗模型預測的準確性，在最優條件下設置3 個平行實驗進行驗證，37 ℃發酵72 h，HPLC分析測定結果。獲得丁二酸產量的平均值為（37.02±0.41）g/L，與預測值基本一致（P＞0.05），這說明建立的模型具有很好的可靠性和重復性。此時，丁二酸得率為66.79%，生產強度為0.51 g/（L·h），與優化前丁二酸產量16.88 g/L相比，提高了1.19 倍。從而也證明了響應面法優化培養基配方的有效性，對于其他發酵條件優化也具有一定的參考價值。

3 結 論

本研究對產琥珀酸放線桿菌GXAS137發酵粗甘油產丁二酸的條件進行優化，提高了丁二酸產量，降低了生產成本。先通過單因素試驗對粗甘油發酵產丁二酸的電子受體、粗甘油質量濃度及氮源進行了優化，又通過響應面試驗確定重要參數的最佳水平。結果表明：DMSO是粗甘油發酵產丁二酸的最適電子受體，玉米漿可替換價格昂貴的酵母粉作為發酵的氮源，各因素的最佳條件為粗甘油55.43 g/L、DMSO 10.35 g/L、玉米漿17.69 g/L，此條件下丁二酸產量達到37.02 g/L，丁二酸得率為66.79%，生產強度為0.51 g/（L·h）。與優化前的丁二酸產量16.88 g/L相比，丁二酸產量提高1.19 倍，說明模型準確有效。研究結果表明產琥珀酸放線桿菌GXAS137可以高效率轉化粗甘油生產丁二酸，不僅可為丁二酸的生物煉制提供廉價的可再生原料，而且還可以廢棄甘油排放帶來的環境問題，實現廢物的資源化，在資源的有效利用及環境保護方面均具有重要意義。

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