骨髓增生異常綜合征患者骨髓間充質干細胞成骨成脂分化潛能及SDF-1、PD-L1表達觀察

龐艷彬，范麗霞，化羅明，薛華，柳嘉，郭慧敏，羅建民，杜欣

(1河北大學附屬醫院，河北保定071000；2河北醫科大學第二醫院；3廣東省人民醫院/廣東省醫學科學院)

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組腫瘤性疾病，其特點是造血功能衰竭并有向急性髓系白血病轉化的風險[1，2]。目前研究[3,4]表明，MDS患者造血干細胞、骨髓微環境和免疫功能均存在異常。出生后，造血干細胞主要存在于骨髓，其所在的局部微環境稱為造血干細胞龕[5]。間充質干細胞(MSC)是構成造血干細胞龕的關鍵成分，具有支持骨髓正常造血和維持骨髓免疫穩定的重要作用[6]。敲除小鼠MSC中的sbds基因導致促炎因子S100A8/9分泌增加，最終導致造血細胞中DNA損傷，這可能是MDS疾病進展的潛在機制[4]。基質細胞衍生因子1(SDF-1)不僅可誘導造血干細胞歸巢、降低細胞對化療藥物的敏感性，還具有維持免疫突觸穩定的作用[7]。程序性細胞死亡因子配體1(PD-L1)是抑制性免疫分子，廣泛表達在抗原提呈細胞上，與T細胞上的配體結合后傳遞抑制信號，通過多種途徑抑制T細胞的增殖、活化和效應功能[8]。本研究觀察了MDS患者骨髓MSC的多向分化潛能及SDF-1、PD-L1的表達變化，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 新診斷且未經治療的MDS患者30例(病例組)，男19例、女11例，年齡34～80歲、中位年齡57歲。根據2008年WHO中MDS的分類標準，難治性血細胞減少伴有多系病態造血(RCMD)10例，環形鐵粒幼細胞性難治性貧血(RARS)2例，難治性血細胞減少伴有原始細胞增多(RAEB)9例，慢性粒單核細胞白血病(CMML)3例，不能分類的MDS(MDS-U)4例，MDS繼發白血病2例。根據IPSS積分將病例組進一步分為低危亞組(IPSS積分判定為低危和中危-Ⅰ)18例和高危亞組(IPSS積分判定為中危-Ⅱ和高危)12例。選擇與病例組性別、年齡相匹配的非惡性血液病患者納入對照組，男9例、女11例，年齡32～73歲、中位年齡55歲。取兩組新鮮骨髓標本用于后續實驗。

1.2 骨髓MSC的分離、培養及多向分化能力鑒定 將兩組新鮮骨髓標本離心獲得骨髓單個核細胞，將其種植在25 cm2的培養瓶，放置在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內培養。72 h后更換培養基并去除非貼壁細胞。每周換液2次，當細胞達到70%～80%融合度后，應用0.25%胰酶消化、1∶3傳代，收獲第2～4代的MSC。參考文獻[8]方法檢測第3代MSC中的CD34、CD45、CD73、CD90、CD109、CD166進行免疫表型鑒定。對第2代的MSC分化能力進行鑒定。成骨細胞分化鑒定：將MSC以2×104/cm2的密度接種在6孔板中，在人MSC成骨分化培養基中培養，14 d后細胞固定，茜素紅染色、照相，在適當的誘導條件下，MSC產生的鈣結節通過茜素紅染色呈現為紅色結節。成脂細胞分化鑒定：將MSC細胞以2×104/cm2密度接種于6孔板中，在MSC成脂誘導分化培養基中培養，培養14 d后細胞固定，油紅染色，照相，MSC在適當的誘導條件下能夠分化產生脂肪滴，油紅染色顯示為紅色結節。

1.3 MSC中SDF-1、PD-L1基因檢測 收集第3代MSC，加入1 mL的TRIzol提取總RNA，取3 μg RNA逆轉錄成cDNA，以此為模板進行PCR擴增。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40循環；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，并在81 ℃各設一次讀板檢測熒光。擴增完成后，再進行熔解曲線分析，以0.17 ℃/s變化速度從55 ℃到95 ℃每隔2 s記錄一次熒光值，可獲得熔解曲線。為了減少各實驗組間的差異，每一標本均設3組平行孔。SDF-1上游引物序列為5′-GCGCCATGAACGCCAAGGTCGTG-3′，下游引物序列為5′-CAATGCACACTTGTCTGTTGTTG-3′；PD-L1上游引物序列為5′-GGTGCCGACTACAAGCGAAT-3′，下游引物序列為5′-TGACTGGATCCACAACCAAAATT-3′；內參β-actin上游引物序列為5′-ATGAGACACACCTAAGGACC-3′，下游引物序列為5′-TATGGAGAAGATTTGGCACC-3′。目的基因的相對數值以2-ΔΔCt表示。

2 結果

2.1 兩組MSC的形態、表型及多向分化潛能 所有對照組來源的MSC均能在體外實現生長，而30例MDS中只有20例患者的MSC實現體外生長。雖然兩組MSC均表現出纖維梭性外觀，但病例組MSC體積較大，多呈現扁平狀外觀(圖1)。兩組MSC具有相似的免疫表型，均表達MSC標記CD73、CD166、CD105和CD90(>95%)，不表達可檢測到水平的CD34、CD45(<2%)。茜素紅和油紅染色結果證實兩組MSC在體外適當誘導分化條件下可以分別向成骨細胞和成脂細胞分化(圖2)，但病例組MSC的成骨細胞分化潛能弱于對照組MSC。

2.2 兩組MSC中SDF-1、PD-L1表達比較 病例組、對照組MSC中SDF-1的 Ct值分別為6.14±1.37、7.25±1.23，PD-L1的 Ct值分別為11.66±0.95、13.27±0.92，表示病例組MSC中SDF-1、PD-L1的表達水平均高于對照組(P均<0.05)。病例組中，低危亞組、高危亞組MSC中SDF-1的 Ct值分別為5.77±1.30、6.88±1.20，兩亞組相比，P>0.05；高危亞組、低危亞組MSC中PD-L1的 Ct值分別為11.15±0.99、12.23±0.64，說明高危亞組的MSC中PD-L1的表達水平高于低危亞組(P<0.05)。

圖1 兩組MSC的形態

注：上圖為成脂分化實驗結果；下圖為成骨分化實驗結果，病例組MSC分化產生的紅色結節明顯少于對照組。

圖2兩組MSC的分化能力鑒定結果

3 討論

MSC具有支持正常造血和維持骨髓免疫穩定的作用，是構成骨髓微環境的關鍵成分[7]。有學者[9]敲除小鼠MSC中編碼核酸內切酶Ⅲ的Dicer1基因導致骨髓出現MDS樣造血，此后MSC的變化在MDS疾病進展中的作用日益受到重視。但目前對MDS患者MSC的免疫調節功能知之甚少。因此，本研究對參與免疫調控的SDF-1、PD-L1表達情況進行了初步分析。

首先，本研究發現病例組來源的MSC與正常MSC具有相似的免疫表型和多向分化潛能，但與正常MSC相比，病例組MSC除細胞形態發生改變以外，成骨細胞分化潛能明顯下降，這與Geyh等[10]的結果類似。但也有研究認為MDS患者MSC的成骨細胞分化潛能并未下降[11]。造成這種差異的原因可能是后者只使用了茜素紅化學染色定性分析MSC成骨細胞分化特點，不能充分反映細胞分化潛能間的數量差異。MDS患者MSC成骨細胞分化潛能下降可能具有重要的意義。動物實驗證實，即使具有相似的形態和免疫表型，但是成骨分化潛能下降的MSC不能在小鼠腎被膜下經歷軟骨內成骨過渡階段后形成適合造血干細胞生存的骨髓微環境[12]。

本研究還發現MDS患者MSC中SDF-1和PD-L1表達明顯升高，與Roversi等[13]的研究結果相似。骨髓活檢結果顯示MDS患者的MSC中CXCL-12的密度明顯高于良性血細胞減少患者。MSC密度增高的MDS患者總生存期明顯下降，死亡風險是低、中等MSC密度患者的3.4倍，進展為急性髓系白血病的風險為低、中等MSC密度患者的2倍[14]，但相關機制并不明確。SDF-1具有趨化作用，參與造血細胞的遷移、活化、歸巢。此外，SDF-1與受體結合后通過激活細胞內GTP酶的方式激活整合素，參與免疫突觸的形成，并維持抗原提呈細胞和T細胞黏附性接觸，維持免疫突觸的穩定，為TCR信號持續發揮作用提供了前提條件[7]。PD-L1廣泛表達在抗原提呈細胞上[15]。PD-L1與T細胞上的同源受體PD-1結合后使PD-1胞質內ITIM和ITSM模序被酪氨酸激酶家族和SHP磷酸化，磷酸化后的ITIM和ITSM進一步招募磷酸化的酪氨酸殘基。SHP可進一步使PI3K/Akt或RAS/MEK/ERK信號通路失活，導致細胞周期停滯；使ZAP70和PKC-θ去磷酸化從而抑制T細胞活化；PD-L1與T細胞上的PD-1結合后，可使初始T細胞轉化為免疫抑制性的調節性T細胞[8]。本研究發現，病例組MSC中SDF-1和PD-L1表達水平高于對照組，且與低危亞組相比，高危亞組MSC中PD-L1表達增高，提示SDF-1、PD-L1可能促進了MDS疾病進展。SDF-1通過趨化作用使進入骨髓的免疫細胞黏附在MSC周圍，與MSC上的其他免疫分子形成穩定的免疫突觸，MSC通過細胞表面的PD-L1抑制T細胞的增殖、活化，或誘導活化的T細胞分化形成調節性T細胞，從而使MDS腫瘤細胞周圍不能產生足夠數量或具有抗腫瘤效應的細胞毒性T細胞[16]。與Wang等[17]的研究結果相似，高危MDC患者的MSC更易形成免疫抑制性的微環境。因此，通過干預MDS患者MSC免疫抑制微環境對腫瘤細胞的保護作用可能是進一步提高MDS治療效果的一種新方式。

總之，本研究證明MDS來源的MSC成骨細胞分化潛能減弱，SDF-1和PD-L1表達增高，且高危患者變化更為明顯；SDF-1和PD-L1可能在MDS疾病進展過程中發揮了重要作用。

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