血清miR-26a、miR-122、AFP聯(lián)合檢測對肝癌的診斷效能

趙文淘，韓留鑫，夏加偉，余向瓊，白彬，沈麗達

(1昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院，云南省癌癥中心，昆明650118；2昆明市第三人民醫(yī)院)

原發(fā)性肝癌起病隱匿、惡性程度高、早期診斷困難、預(yù)后差[1,2]。甲胎蛋白(AFP)作為一個重要的肝癌診斷標(biāo)志物在臨床上廣泛應(yīng)用，但其敏感度僅為39%～65%、特異度為76%～94%，診斷效率有限[3]。因此尋找高敏感度、高特異度的肝癌診斷標(biāo)志物是臨床亟待解決的難題。微小RNA(miRNAs)是一類長度約22個核苷酸序列的單鏈非編碼小RNA，在肝臟中表達豐富，其通過調(diào)控特定的靶基因表達在新陳代謝、發(fā)育、凋亡、分化、病毒感染及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用[4]。miRNAs表達改變可能是肝炎、肝癌發(fā)生的關(guān)鍵機制[5,6]。現(xiàn)已經(jīng)證實，外周血中的miRNAs可作為早期診斷肝癌的標(biāo)志物[7]。miR-122是含量最豐富的肝臟特異miRNA，占肝臟miRNAs的70%[8]，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)miR-122可抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移[6]。也有研究[9]報道，miR-26a參與了肝癌的發(fā)生及發(fā)展過程，在肝癌動物模型體內(nèi)上調(diào)miR-26a表達后，癌結(jié)節(jié)可消退[10]。本研究觀察了血清miR-26a、miR-122聯(lián)合AFP檢測在肝癌診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(云南省腫瘤醫(yī)院)2016年10月～2017年3月收治的新發(fā)肝癌患者114例(肝癌組)，其中男100例、女14例；年齡(51.8±11.5)歲；乙型肝炎108例，丙型肝炎4例，無肝炎2例；所有患者均經(jīng)穿刺活檢或術(shù)后病理證實為原發(fā)性肝細胞癌，并未進行過針對性抗腫瘤治療。另選新發(fā)肝炎患者87例(肝炎組)，其中男61例、女26例；年齡(44.2±12.8)歲；所有患者均臨床確診為乙型肝炎(78例)或丙型肝炎(9例)，且未經(jīng)抗病毒治療。隨機選取同期來院做健康體檢的健康人94例為對照組，其中男44例、女50例；年齡(40.2±10.2)歲；排除腫瘤、傳染病等病史。抽取三組外周血，收集血清，置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 血清miR-26a、miR-122檢測 采用TRIzol試劑和RNA提取試劑盒提取血RNA[11]。用Nanodrop ND-1000檢測儀檢測RNA濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA[12]。利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)數(shù)據(jù)庫，確定基因序列。使用軟件Primer premier5.0進行引物設(shè)計。以cel-miR-39為內(nèi)參，上游引物序列為5′-GCGGTCACCGGGTGTAAATC-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-26a逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA-

CTGGATACGACAGCCT-3′，其qPCR反應(yīng)時的上游引物為5′-GACTGTTCAAGTAATCCAGGATA-3′，下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；miR-122上游引物序列為5′-GACTGTGGAGTGTGACAATGGTG-3′，下游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。qPCR反應(yīng)體系20 μL，包括cDNA 1.33 μL、2×Taqman PCR master mixture 10 μL、TaqMan MicroRNA Assay 1 μL、ddH2O 7.67 μL。用ABI7500型實時定量PCR儀進行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，進行40個循環(huán)反應(yīng)。以cel-miR-39作為內(nèi)參，采用公式[11]計算miRNA相對表達量，ΔCtmiRNA值越低代表miRNA的表達水平越高。

1.3 血清AFP檢測 采用電化學(xué)發(fā)光法檢測三組血清AFP。

2 結(jié)果

肝癌組、肝炎組、對照組中miR-26a ΔCtmiRNA值分別為20.59±2.54、15.96±3.79、15.29±2.10，miR-122 ΔCtmiRNA值分別為8.35±2.90、11.48±3.06、13.79±2.84，AFP水平分別為(18 207.78±3 701.95)、(12.15±2.79)、(3.51±0.17)ng/mL。肝癌組miR-26a相對表達量低于肝炎組和對照組，AFP水平高于肝炎組和對照組，肝癌組、肝炎組、對照組miR-122相對表達量依次降低(P均<0.05)。

分析miR-26a、miR-122在肝癌診斷中的效能結(jié)果顯示，miR-26a、miR-122均可作為鑒別肝癌患者和健康人的標(biāo)志物：miR-26a單項檢測AUC為0.738(95%CI為0.631～0.846)，miR-122單項檢測的AUC為0.828(95%CI為0.736～0.919)。miR-26a檢測診斷臨界值為18.26，敏感度和特異度分別為52.1%、94.3%；miR-122檢測診斷臨界值為10.63，敏感度和特異度分別為79.9%、84.8%。AFP單項檢測AUC為0.801(95%CI為0.702～0.900)，敏感度和特異度分別為59.2%、93.7%。miR-26a、miR-122、AFP聯(lián)合檢測AUC為0.926(95%CI為0.871～0.981)，敏感度和特異度分別為86.4%、82.5%。三項指標(biāo)聯(lián)合檢測對肝癌的診斷效能高于單一指標(biāo)檢測。

分析miR-26a、miR-122在肝癌和肝炎鑒別診斷中的效能結(jié)果顯示，miR-26a單項檢測AUC為0.752(95%CI為0.645～0.860)，miR-122單項檢測AUC為0.688(95%CI為0.571～0.806)。miR-26a檢測診斷臨界值為16.81，敏感度和特異度分別為73.9%、72.4%；miR-122檢測診斷臨界值為9.01，敏感度和特異度分別為78.2%、59.4%。AFP單項檢測AUC為0.701(95%CI為0.587～0.816)，敏感度和特異度分別為58.3%、92.6%。miR-26a、miR-122、AFP聯(lián)合檢測AUC提高到0.865(95%CI為0.781～0.949)，敏感度和特異度分別為76.5%、85.1%。三項指標(biāo)聯(lián)合檢測對肝癌和肝炎的鑒別診斷效能優(yōu)于單項指標(biāo)檢測。

3 討論

肝癌惡性程度高、起病隱匿，早期診斷并手術(shù)切除是延長患者生存期的關(guān)鍵，但多數(shù)通過影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的肝癌已為晚期，失去手術(shù)機會。目前除了影像學(xué)診斷方法，實驗室主要通過檢測血清AFP來輔助診斷肝癌，但AFP的診斷效率有限，有近三分之一的早期肝癌被漏診[13]。因此，急需尋找一種準(zhǔn)確、便捷的診斷肝癌的血清學(xué)指標(biāo)。

miRNAs調(diào)控著人類基因組中超過60%的基因表達，某個miRNA的表達變化能夠影響著數(shù)百個靶基因表達，并顯著改變了轉(zhuǎn)錄組基因的表達譜[14]。包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生可能是miRNAs表達譜改變所導(dǎo)致的。研究表明，肝臟中的miRNAs通過凋亡、壞死等過程或通過外泌體分泌、病毒顆粒分泌等過程，釋放入外周血中，并且miRNAs在外周血中的表達相當(dāng)穩(wěn)定[15]，可以作為肝癌早期診斷標(biāo)志物[7]。

miR-26a在肝癌中發(fā)揮著抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的功能[9]。Zhou等[16]研究顯示，miR-26a在肝癌患者外周血中的表達低于健康對照者，外周血中miR-26與其他六個miRNAs(miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-27a、miR-801)的組合檢測有助于診斷肝癌。Tan等[17]的研究也顯示miR-26a在肝癌患者外周血中的表達低于健康對照者，外周血中miR-26a、miR-206、miR-141-3p、miR-433-3p、miR-1228-5p、miR-199a-5p、miR-122-5p、miR-192-5p聯(lián)合檢測也可用于肝癌的診斷。miR-122作為含量最豐富的肝臟特異miRNA，發(fā)揮著抑制肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的功能[6]。多項研究[12，18～20]結(jié)果顯示，miR-122在肝癌患者外周血中的表達高于健康對照者，將miR-122與其他miRNAs聯(lián)合檢測可用于肝癌的診斷。

在本研究中，我們檢測了三組血清miR-26a、miR-122、AFP，并評價了三項指標(biāo)檢測在肝癌診斷中的應(yīng)用價值。研究結(jié)果顯示，肝癌組miR-26a相對表達量低于肝炎組和對照組，AFP水平高于肝炎組和對照組，肝癌組、肝炎組、對照組miR-122相對表達量依次降低。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-26a、miR-122、AFP單項檢測診斷肝癌的AUC分別為0.738、0.828、0.801，三項指標(biāo)聯(lián)合檢測的AUC提高到0.926，對肝癌的診斷效能明顯提高。同時，我們還評價了miR-26a、miR-122、AFP單項與聯(lián)合檢測在肝癌和肝炎鑒別診斷中的價值，結(jié)果顯示三項指標(biāo)同樣能將肝癌和肝炎患者進行鑒別，miR-26a、miR-122、AFP單項檢測的AUC分別為0.752、0.688、0.701，三項指標(biāo)聯(lián)合檢測的AUC則提高到0.865。以上研究結(jié)果說明，miR-26a、miR-122可以作為肝癌的診斷標(biāo)志物，并且與AFP單獨檢測相比，miR-26a、miR-122、AFP聯(lián)合檢測對肝癌的診斷效率明顯提高。上述研究結(jié)果與既往相關(guān)報道一致，且本研究只將兩個指標(biāo)與臨床常用的AFP聯(lián)合檢測即達到較高的診斷效能，優(yōu)化了診斷方法。本研究提供了一種準(zhǔn)確、便捷的肝癌血清學(xué)診斷方法，但還需大樣本的前瞻性研究來進一步驗證。

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