上皮性卵巢癌組織中Nanog、FOXD3 mRNA及蛋白的表達變化

臧星卉，李紅雨，孫瑋，魚志琪，劉端，李玉光

(鄭州大學第三附屬醫院，鄭州450052)

卵巢癌最常見的類型是上皮性卵巢癌。上皮性卵巢癌病死率較高，在過去25年間總生存期改善較小[1]。因此，探究上皮性卵巢癌發生、發展、侵襲、轉移的相關機制有著重要意義。胚胎干細胞關鍵因子(Nanog)表達于全能或多能干細胞中，是維持胚胎干細胞自我增殖和多向分化潛能的關鍵性轉錄因子。有學者推測Nanog與腫瘤發病有關[2,3]。Nanog通過調控腫瘤干細胞、細胞分化、上皮間質轉化(EMT)、化療耐藥及免疫耐受等多種機制參與腫瘤發生發展的多個環節[4]。FOX指叉頭框轉錄因子家族，主要在干細胞中表達，發揮調控胚胎干細胞亞全能性與增殖分化的作用。研究發現，FOX基因通過EMT介導腫瘤干細胞的形成過程、維持腫瘤干細胞的特性及腫瘤耐藥[5]。FOXD3是FOX家族的一員。研究[6]報道，FOXD3可通過調節相關蛋白(如E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、層黏連蛋白等)的表達而誘導EMT，從而賦予細胞遷移能力。目前對FOXD3基因的研究甚少，其表達調控機制尚不清楚。本研究觀察了上皮性卵巢癌組織中Nanog、FOXD3 mRNA及蛋白的表達變化，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 2015年1月～2017年3月于鄭州大學第三附屬醫院手術留取的上皮性卵巢癌組織40例份(惡性組)，良性卵巢上皮性腫瘤組織26例份(良性組)，正常卵巢組織25例份(對照組)。惡性組標本來源患者年齡13～75歲；漿液性囊腺癌27例、黏液性囊腺癌5例、子宮內膜樣癌6例、透明細胞癌2例；FIGO分期Ⅰ期11例、Ⅱ期5例、Ⅲ期18例、Ⅳ期6例；低分化23例、中等分化10例、高分化7例；行淋巴結清掃共23例，有轉移11例、無轉移12例；所有患者術前均未接受放療、化療、激素及免疫治療，除外其他轉移性癌。良性組標本來源患者年齡9～63歲；漿液性囊腺瘤和黏液性囊腺瘤各13例。對照組標本來源患者包括子宮內膜癌12例、宮頸癌8例、其他病變5例，經病理證實為正常卵巢組織。各組均留兩份標本待測。

1.2 Nanog、FOXD3 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。將三種組織在液氮中磨碎，每80～100 mg組織加入1 mL的RNA提取液，總RNA被提取后，用紫外分光光度計分別測定純度及濃度。提取1 μg總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書將其逆轉錄成cDNA，逆轉錄反應體系為25 μL，反應條件為37 ℃孵育1 h。取cDNA 2μL進行PCR反應，總反應體系為20 μL。反應條件為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。目的基因的相對表達量用2-ΔΔCt表示。

1.3 Nanog、FOXD3蛋白檢測 采用免疫組化SP法。取三組石蠟標本做4 μm厚切片，脫蠟、水化，高溫抗原修復，血清修復，加一抗，然后加二抗，DAB染色，蘇木紫復染，脫水，透明，最終封片。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性組織切片作為陽性對照。采用半定量計數法進行結果判定。于高倍鏡(400×)視野下隨機地選擇5個視野(每個視野細胞數目不少于100個)。根據細胞著色強度計分，無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；根據陽性細胞百分比計分，0計0分，<25%計1分，25%～<50%計2分，50%～<75%計3分，75%～100%計4分；上述兩項得分相乘，0～1為蛋白表達陰性，≥2為蛋白表達陽性。

2 結果

2.1 三組Nanog、FOXD3 mRNA表達比較 對照組、良性組、惡性組Nanog mRNA相對表達量分別為0.827±0.243、1.009±0.747、3.266±1.413，FOXD3 mRNA相對表達量分別為0.571±0.266、0.976±0.369、1.457±0.496。惡性組Nanog、FOXD3 mRNA相對表達量高于良性組及對照組，且良性組FOXD3 mRNA相對表達量高于對照組(P均<0.05)。

2.2 三組Nanog、FOXD3蛋白表達比較 Nanog及FOXD3主要表達于卵巢上皮組織細胞質內，呈棕黃色、顆粒狀分布。上皮性卵巢癌組織中Nanog、FOXD3蛋白均呈強表達，卵巢正常組織和良性卵巢上皮性腫瘤中Nanog、FOXD3蛋白呈弱表達甚至不表達。對照組、良性組、惡性組Nanog蛋白陽性表達率分別為24.0%、34.6%、80.0%，FOXD3蛋白陽性表達率分別為20.0%、65.0%、87.5%。惡性組Nanog、FOXD3蛋白陽性表達率高于良性組及對照組，且良性組FOXD3蛋白陽性表達率高于對照組(P均<0.05)。

2.3 Nanog、FOXD3蛋白表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數的關系 Nanog蛋白表達與上皮性卵巢癌患者年齡、腫瘤組織學類型、淋巴結轉移無關(P均>0.05)，而與臨床分期、分化程度有關，其中Ⅲ、Ⅳ期組織中Nanog蛋白表達高于Ⅰ、Ⅱ期組織，低分化組織中Nanog蛋白表達高于中、高分化組織(P均<0.05)。FOXD3蛋白表達與上皮性卵巢癌患者的年齡、腫瘤組織學類型、臨床分期、分化程度及淋巴結轉移等無關(P均>0.05)。詳見表1。

表1 Nanog、FOXD3蛋白陽性表達與上皮性卵巢癌臨床病理參數的關系(例)

注：與Ⅲ、Ⅳ期組織相比，*P<0.05；與低分化組織相比，#P<0.05。

2.4 上皮性卵巢癌組織中Nanog、FOXD3蛋白表達的相關性 Spearman相關分析結果顯示，上皮性卵巢癌組織中Nanog、FOXD3蛋白表達呈正相關(r=0.652，P<0.01)。

3 討論

文獻[7]報道Nanog能作用于下游基因E-鈣黏蛋白和叉頭框轉錄因子J1(FOXJ1)，通過抑制二者的表達促進卵巢癌細胞侵襲、轉移;在術后經聯合化療的卵巢癌患者中，Nanog核內表達的增高與耐藥性產生及患者低生存率相關。黃清梅等[8]發現隨Nanog基因表達增強，胃癌細胞株對順鉑的敏感性減弱。Wang等[9]提出Nanog高表達提示乳腺癌患者預后不良。本研究結果顯示，Nanog基因及蛋白在惡性組中的表達明顯高于良性組及對照組，提示Nanog可能促進細胞增殖分化，參與了上皮性卵巢癌的形成。其次，Nanog蛋白表達與上皮性卵巢癌臨床分期及分化程度有關，期別越晚、分化程度越低則蛋白陽性表達越高，提示Nanog可能在上皮性卵巢癌的進展中占重要地位，其高表達可能提示患者預后不良，或許能通過干擾Nanog的表達抑制腫瘤進展。本研究發現，良性卵巢上皮腫瘤及正常卵巢組織中Nanog均呈低表達或不表達，提示Nanog有望成為上皮性卵巢癌的檢測標志物和治療靶點，從而為卵巢癌的診斷、治療提供新的思路。

Chu等[10]研究顯示FOXD3可通過誘導EMT而促進乳腺癌發病及腫瘤淋巴結轉移。Chen等[11]發現FOXD3在腦膠質瘤中高表達，且表達水平與患者的預后呈負相關。本研究中，惡性組FOXD3基因及蛋白的表達高于良性組及對照組，且良性組FOXD3基因及蛋白的表達高于對照組，提示其可能發揮促癌基因的作用，推測其可能通過介導EMT促進細胞增殖及卵巢癌的發生。我們同時發現，FOXD3蛋白的表達與患者年齡、組織學類型、臨床分期、分化程度、淋巴結轉移均無關。然而，FOXD3也被報道在神經源性腫瘤中可通過抑制腫瘤增殖、侵襲、遷移、新生血管形成等一系列作用從而充當抑癌基因的角色[12]。Li等[13]報道在結直腸癌腫瘤中，FOXD3可抑制腫瘤細胞體外侵襲和肺轉移能力。可見，FOXD3在人體不同腫瘤組織中的作用不盡相同。目前針對FOXD3在卵巢腫瘤組織中的表達與臨床意義的相關研究較少，因此，FOXD3在卵巢癌發生、發展、浸潤、遷移、耐藥等過程中的作用及其機制仍有待繼續探究。

Nanog和FOXD3作為參與胚胎干細胞自我更新的轉錄因子，既維持了胚胎干細胞的多能性，在胚胎早期發育中發揮重要作用，也與多種腫瘤息息相關，兩者關系密切而又復雜。有研究稱FOXD3可與Nanog啟動子連接，激活Nanog表達，并通過正反饋增加二者的表達[14]。也有研究提出FOXD3是Nanog的核心下游靶基因[15]。本研究發現，在上皮性卵巢癌中，Nanog和FOXD3的表達呈正相關，提示在上皮性卵巢癌的發生發展過程中，Nanog與FOXD3可能存在協同作用，具體機制尚待明確。

綜上所述，上皮性卵巢癌組織中Nanog、FOXD3 mRNA及蛋白表達增高，Nanog、FOXD3可能參與了上皮性卵巢癌的發生、發展，且二者之間可能存在協同作用。然而本研究樣本量有限，且未將腹水和腹腔沖洗液中是否存在腫瘤細胞的因素考慮在內，后續研究還需盡可能擴大樣本量并完善分組。

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