miR-1表達變化對食管鱗癌細胞增殖、凋亡及侵襲成瘤能力的影響

程秀蓮 ，劉琨

(張家口市第一醫(yī)院，河北張家口075000)

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤[1,2]，其中我國某些地區(qū)的發(fā)病率和病死率居世界之首，如河南林縣地區(qū)等[3]。食管癌的病理類型根據(jù)地域不同也呈現(xiàn)明顯的集中趨勢，在亞洲國家如中國和日本，食管癌的主要類型是鱗狀細胞癌(ESCC)，歐美國家則主要是腺癌(EAC)[4]。因此ESCC這一我國多發(fā)的食管癌類型值得深入研究。導(dǎo)致食管癌病死率高的原因是腫瘤細胞的侵襲增殖能力強和早期即出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，因此闡明食管癌惡性表型發(fā)生發(fā)展的分子機制，對于食管癌的防治具有重要意義。miRNA是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，主要通過結(jié)合下游靶基因來調(diào)節(jié)基因的表達[5]。最近研究[6]表明，miRNA參與食管癌的惡性轉(zhuǎn)歸，提示其與食管癌的發(fā)生密切相關(guān)。miR-1對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力調(diào)控的分子機制多樣，在不同器官組織之間差異更為明顯。本研究觀察了miR-1表達變化對食管鱗癌細胞增殖、凋亡及侵襲、成瘤能力的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 食管鱗癌細胞株TE1、TE-13、EC9706、Kyse70、Kyse140、Kyse150、Kyse450和正常食管上皮細胞株Het-1A均來自我院生物實驗室。鼠齡6～8周的Balb/c雄性裸鼠14只。TRIzol，PrimeScript RT reagent Kit，SYBR Premix Ex Taq real time PCR kit，PCR引物(生工生物工程有限公司合成)，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒，大腸桿菌菌株DH5α，293T細胞株，限制性內(nèi)切酶，T4連接酶，CCK-8試劑，Transwell 小室，細胞凋亡檢測試劑盒。

1.2 miR-1表達變化對食管鱗癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲能力的影響觀察

1.2.1 食管鱗癌細胞分組及miR-1轉(zhuǎn)染方法 采用real-time PCR法檢測食管正常上皮細胞Het-1A和7個食管鱗癌細胞株ECA109、KYSE140、TE1、KYSE150、ECA9706、TE13、KYSE450中的miR-1，以U6作為內(nèi)參，結(jié)果顯示在各食管鱗癌細胞株中miR-1相對表達量均低于食管正常上皮細胞，其中miR-1在KYSE450中表達量較高，在KYSE150表達量較低，所以選取KYSE450、KYSE150細胞做進一步實驗。將KYSE150細胞分為過表達組、抑制組和對照組。過表達組細胞轉(zhuǎn)染pHBLV-miR-1慢病毒，抑制組轉(zhuǎn)染miR-1抑制劑，對照組不做特殊處理。采用qRT-PCR法檢測各組細胞中的miR-1，過表達組、抑制組、對照組中miR-1相對表達量分別為412.25±11.22、0.32±0.11、1.00±0.01，過表達組miR-1相對表達量顯著高于抑制組、對照組，抑制組miR-1相對表達量顯著低于對照組。

1.2.2 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將三組細胞接種于96孔板中，每孔1 500～2 000個細胞，每孔加100 μL的培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h時每孔加入10 μL的CCK-8試劑，37 ℃孵育2～4 h后用酶標儀檢測450 nm波長光密度值(OD值)，表示細胞增殖能力。

1.2.3 細胞凋亡率測算 將KYSE150接種于6孔板，按前述方法進行瞬時轉(zhuǎn)染，細胞轉(zhuǎn)染72小時后收集細胞，消化各組細胞，1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。棄上清，用冰箱預(yù)冷過的PBS溶液重懸細胞，然后再次1 000 r/min離心5 min，重復(fù)步驟1次。用200 μL的Bindingburfer重懸細胞。加入5 μL的AnllexinⅤ-FITC，輕柔混勻，室溫下暗處孵育15 min。加入10 μL的PI，暗處孵育5 min后加入300 μL的Bindingbuffer混勻，上機。ModFit LT軟件分析測算細胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細胞侵襲能力檢測 將KYSE150接種于6孔板，按前述方法進行瞬時轉(zhuǎn)染，細胞轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞，按1∶3的比例混合Matrigel和無血清培養(yǎng)基制備成人工基底膜；將濾膜完整的小室放入24孔板中，于上室各加入50 μL上述混合液；每個Transwell小室內(nèi)接種各組細胞懸液(1×105/100 μL)，并在下室中加入500 μL含10%血清的細胞培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h后取出小室，棄去小室內(nèi)的殘余培養(yǎng)液；將小室置于無水乙醇中固定30 min，PE染色；PBS清洗2遍，用棉拭子輕柔擦去小室內(nèi)表面未能侵襲的細胞，將小室置于新的24孔板中，于倒置相差顯微鏡下觀察小室外表面的細胞并拍照計數(shù)；記錄5個視野的穿膜細胞數(shù)，將5個視野數(shù)值相加，獲得穿膜細胞數(shù)。

1.3 miR-1表達變化對KYSE150細胞成瘤能力的影響觀察 將裸鼠分為A、B、C組，每組5只，將3×106/300 μL的KYSE150細胞于雙側(cè)腋部皮下注入裸鼠皮下，A組接種轉(zhuǎn)染pHBLV-miR-1的KYSE150細胞，B組接種轉(zhuǎn)染miR-1抑制劑的KYSE150細胞，C組接種不作特殊處理的KYSE150細胞觀察各組裸鼠活動、排便、體毛、體重變化；2周后觀察裸鼠成瘤情況；分別于第4周末和第6周末處死各組裸鼠，測量腫瘤體積及質(zhì)量。

2 結(jié)果

2.1 各組KYSE150細胞增殖能力比較 培養(yǎng)24、48、72 h后，抑制組、對照組、過表達組KYSE150細胞增殖能力依次減弱(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組KYSE150細胞OD值

注：與對照組相比，*P<0.05；與過表達組相比，#P<0.05。

2.2 各組KYSE150細胞凋亡率比較 對照組、過表達組、抑制組細胞凋亡率分別為20%±1%、42%±2%、8%±2%，其中過表達組細胞凋亡率最高，抑制組細胞凋亡率小于對照組(P均<0.05)。

2.3 各組KYSE150細胞侵襲能力比較 對照組、過表達組、抑制組穿膜細胞數(shù)分別為53.68±4.26、41.56±3.18、82.34±7.56，其中過表達組穿膜細胞數(shù)最少，抑制組穿膜細胞數(shù)高于對照組(P均<0.05)。

2.4 各組裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量比較 A、B、C組裸鼠移植瘤體積分別為(1 732.58±89.48)、(482.35±32.16)、(2 431.69±44.48)mm3，腫瘤質(zhì)量分別為(2 123.66±92.38)、(513.27±38.46)、(3 132.33±49.58)mg，其中B組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量最小，C組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量高于A組(P均<0.05)。

3 討論

食管癌是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一，早期食管癌經(jīng)手術(shù)及放化療綜合治療后5年復(fù)發(fā)率仍然高達30%。大部分(約75%)食管癌患者就診時已處于中晚期，失去了外科手術(shù)的最佳時機，極易復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移，Ⅰ～Ⅳ期患者總體5年生存率僅約10%[5]。因此，研究食管癌的發(fā)病及進展機理，有利于闡明食管癌細胞惡性表型的調(diào)控機制[6]，對食管癌的早期診斷、預(yù)后評估、延長患者生存期及選擇適當(dāng)?shù)闹委煼绞蕉季哂袠O為重要的意義。

miR-1家族包括2個miRNA即miR-1-1和miR-1-2。miR-1-1和miR-1-2是幾乎相同的基因，兩者均位于相關(guān)編碼基因的內(nèi)含子區(qū)。其中，位于人20號染色體上C20orf166基因初級轉(zhuǎn)錄本第2個內(nèi)含子區(qū)的是miR-1-1，位于人18號染色體上蛋白質(zhì)編碼基因MIB1第12個內(nèi)含子區(qū)的是miR-1-2[7，8]。miR-1-1和miR-1-2不僅僅是構(gòu)成幾乎相同，而且其成熟產(chǎn)物miR-1及兩者作用的靶基因也幾乎相同[9]。miR-1的正常表達對于維持心臟功能不可或缺[10]，miR-1異常表達可導(dǎo)致相關(guān)心血管疾病，如心肌發(fā)育不良、室中隔缺損、心率失常等。近年來越來越多的研究表明miR-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用，miR-1表達下調(diào)是多種腫瘤中最常見的事件之一。在肺癌中，miR-1可逆轉(zhuǎn)肺癌細胞的增殖、遷移等惡性生物學(xué)表型，如檢測血清miR-1對評估非小細胞肺癌患者預(yù)后具有一定的臨床價值。

Guo等[11～13]首次報道了食管鱗癌中miRNA的表達譜，采用miRNA芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)了在食管鱗癌和癌旁正常組織中表達差異很大的7種miRNA，其中hsa-miR-103/107與食管鱗癌患者預(yù)后明顯相關(guān)。食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多水平、多基因參與的復(fù)雜性生物學(xué)過程。miRNA可能在多個維度都參與了食管鱗癌的惡性轉(zhuǎn)歸，特別是參與了早期食管鱗癌的發(fā)生過程[14～17]。miRNA可能通過調(diào)節(jié)與增殖、周期、凋亡、遷移、侵襲和耐藥性等相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能而影響食管鱗癌的惡性表型[18～20]。

本研究觀察了miR-1表達變化對食管鱗癌細胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響，結(jié)果顯示培養(yǎng)24、48、72 h后，抑制組、對照組、過表達組KYSE150細胞增殖能力依次減弱；過表達組細胞凋亡率最高，抑制組細胞凋亡率小于對照組；過表達組遷移細胞數(shù)最少，抑制組遷移細胞數(shù)高于對照組。這提示miR-1過表達可抑制食管鱗癌細胞的增殖、侵襲能力并促進細胞凋亡，而干擾miR-1則起到相反的作用，提示miR-1在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中可能扮演著抑癌基因的角色。為了進一步觀察miR-1在體內(nèi)對食管鱗癌的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了分別將過表達、低表達miR-1的食管鱗癌細胞接種于裸鼠皮下，結(jié)果顯示B組裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量最小，C組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量高于A組，提示miR-1過表達可抑制食管鱗癌細胞的體外成瘤能力，反之抑制miR-1表達則可增強食管鱗癌細胞的體外成瘤能力。本研究的開展不僅有助于更深入理解食管鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展機制，而且可為食管鱗狀細胞癌的診斷、預(yù)后相關(guān)工作提供新的研究基礎(chǔ)，并為其治療提供新的思路和方向。

參考文獻：

[1] 陳文慶,張依軍,蔡三立,等.凋亡蛋白Smac與食管癌[J].中國實驗診斷學(xué),2016,20(11):1977-1979.

[2] 付文博,宋亞芹,楊蘭,等.miR-21在食管癌中預(yù)后作用的meta分析[J].中國老年學(xué)雜志,2015,35(16):4567-4569.

[3] 姜玉勃,趙傳華,李珊珊,等.食管癌圍手術(shù)期治療的研究現(xiàn)狀和進展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2015,20(2):185-190.

[4] Xie FJ, Zhang YP, Zheng QQ, et al. Helicobacter pylori infection and esophageal cancer risk: an updated meta-analysis [J]. World J Gastroenterol, 2013,19(36):6098-6107.

[5] 鄒文斌,王貴齊,李兆申,等.早期食管癌及癌前病變內(nèi)鏡下切除治療的發(fā)展與現(xiàn)狀[J].中華消化內(nèi)鏡雜志,2014,(9):545-554.

[6] Osaka E, Yang X, Shen JK, et al. MicroRNA-1 (miR-1) inhibits chordoma cell migration and invasion by targeting slug [J]. J Orthop Res, 2014,32(8):1075-1082.

[7] Fu JD, Rushing SN, Lieu DK, et al. Distinct roles of microRNA-1 and -499 in ventricular specification and functional maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes [J]. PLoS One, 2011,6(11):e27417.

[8] Heidersbach A, Saxby C, Carver-Moore K,et al. microRNA-1 regulates sarcomere formation and suppresses smooth muscle gene expression in the mammalian heart [J]. Elife, 2013,2(1630):e01323.

[9] Tao G, Martin JF. MicroRNAs get to the heart of development [J]. Elife, 2013,2(2):e01710.

[10] Han C, Yu Z, Duan Z, et al. Role of microRNA-1 in human cancer and its therapeutic potentials [J]. Biomed Res Int, 2014,2014(1):428371.

[11] Guo Y, Chen Z, Zhang L, et al. Distinctive microRNA profiles relating to patient survival in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Cancer Res, 2008,68(1):26-33.

[12] 路軍,薛麗燕,金木蘭,等.早期食管鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)微小RNA的表達[J].中華病理學(xué)雜志,2014,43(5):313-317.

[13] 李迎迎,劉志廣,王麗,等.血清miRNAs作為食管鱗癌新的生物標志物[J].遺傳,2015,37(4):315-320.

[14] 陳鑫,車少敏,惠蓓娜,等.食管鱗癌放射抗拒的相關(guān)microRNA篩選[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013,34(3):296-301.

[15] 杜彥艷,趙連梅,陳亮,等.微小RNA-1抑制食管鱗癌細胞遷移侵襲及其機制[J].中華實驗外科雜志,2016,33(8):1962.

[16] 李志華,李紹鵬,魏春勇,等.miRNA在食管鱗癌癌變機理中的作用研究[J].海南醫(yī)學(xué),2015,26(13):1885-1886,1887.

[17] 路軍, 薛麗燕, 金木蘭,等. 早期食管鱗狀細胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)微小 RNA 的表達[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2014, 43(5):313-317.

[18] Zhang N, Fu H, Song L, et al. MicroRNA-100 promotes migration and invasion through mammalian target of rapamycin in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Oncol Rep, 2014,32(4):1409-1418.

[19] Wang X, Li M, Wang Z, et al. Silencing of long noncoding RNA MALAT1 by miR-101 and miR-217 inhibits proliferation, migration, and invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells [J]. J Biol Chem, 2015, 290(7):3925-3935.

[20] Jiang L, Wang Y, Rong Y, et al. miR-1179 promotes cell invasion through SLIT2/ROBO1 axis in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(1):319-327.