白藜蘆醇對人前列腺癌細胞株PC-3增殖、凋亡的影響及其機制

張萬生，趙榮，田豐雨，侯建成，趙行宇

(吉林醫藥學院，吉林吉林132013)

還具有各廣譜抗腫瘤活性，其對白血病、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[5～7]，但其抗前列腺癌的作用鮮有報道。本研究觀察了不同濃度白藜蘆醇對人前列腺癌細胞系PC-3增殖、凋亡的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 PC-3細胞由吉林醫藥學院科學實驗室保存，并以含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養。白藜蘆醇購自美國Sigma公司，純度99%，購買的白藜蘆醇溶于二甲基亞砜(DMSO)中，4 ℃儲存。MTT、DMSO購于Sigma公司。兔抗人Bcl-2、Bax、cleave-Caspase-3、PARP和β-actin單克隆抗體及抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞分組與白藜蘆醇用法 將PC-3細胞分為對照組和實驗1、2、3、4組。實驗1、2、3、4組分別給予10、50、100、150 μmol/L的白藜蘆醇處理24 h；對照組不加入藥物。

1.3 細胞增殖抑制率測算 采用MTT法。將對數生長期的PC-3細胞以3×104/孔的終濃度接種到96孔板中。各組細胞加藥處理24 h后，向每個孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)。孵育4 h后，丟棄MTT培養基，將紫色甲臜晶體溶解于DMSO中。在570 nm處使用自動微孔板讀數器測定對照組和各實驗組孔中的光密度值(OD值)。按公式計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。實驗重復3次，求均值。

1.4 細胞凋亡率測算 按細胞凋亡檢測試劑盒進行操作。各組給藥24 h后收集細胞并用冰冷的PBS洗滌2次。隨后將細胞重懸于緩沖液中，并在Annexin V-FITC、PI中在室溫下避光染色15 min。借助流式細胞術測算細胞凋亡率。

1.5 細胞凋亡相關蛋白檢測 各組處理24 h后，搜集細胞并用冷PBS洗滌2次。將所得細胞用裂解緩沖液在冰上裂解10 min。4 ℃下以12 000 g離心10 min，將上清液轉移到新鮮管中-70 ℃儲存。用BDA檢測試劑盒測定蛋白濃度。將50 μg蛋白質樣品在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳，隨后轉移到PVDF膜。在室溫下，用Tris緩沖鹽水中的5%非脂肪乳封閉膜2 h，然后加入P53、Cleave-Caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)(1∶5 000)及β-actin(1∶1 000)一抗，在Tris緩沖鹽水中于4 ℃過夜。洗滌后加入二抗在室溫下培養2 h。采用Image Pro Plus軟件和電化學發光(ECL)系統，分析化學發光強度，以目的蛋白條帶發光值與內參條帶發光值的比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 白藜蘆醇處理24 h后對PC-3細胞形態具有顯著影響，主要表現為細胞數量減少，圓形細胞和細胞脫離，表明細胞死亡(圖1)。對照組及實驗1、2、3、4組OD值分別為0.998±0.165、0.683±0.131、0.565±0.090、0.375±0.108、0.285±0.070，各組OD值依次遞減(P均<0.05)；實驗1、2、3、4組細胞增殖抑制率分別為31.42%±10.13%、42.31%±12.76%、61.76%±12.72%、70.96%±8.29%，各實驗組細胞增殖抑制率依次遞增(P均<0.05)。可見白藜蘆醇在處理24 h后對PC-3細胞具有顯著的細胞毒作用，呈劑量依賴性，計算得IC50值為23.25 μmol/L。

圖1 各組細胞給藥24 h后形態

2.2 各組細胞凋亡率比較 對照組及實驗1、2、3、4組細胞凋亡率分別為3.35%±0.62%、5.47%±0.87%、7.64%±1.25%、9.56%±1.55%、14.64%±2.21%，各組細胞凋亡率依次遞增(P均<0.05)。

2.3 各組凋亡相關蛋白表達比較 實驗1、2、3、4組細胞中P53、PARP(89 kD)相對表達量高于對照組，實驗2、3、4組細胞中Cleave-Caspase-3相對表達量高于對照組，實驗1、2、3、4組細胞中P53、PARP(89 kD)、Cleave-Caspase-3相對表達量依次增高(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組細胞中凋亡相關蛋白相對表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

細胞凋亡是程序性細胞死亡過程，不論是在正常生長發育、組織結構改建中還是在腫瘤的發生發展中都非常重要。現已證實，由凋亡產生的損傷作用也是惡性腫瘤發展的關鍵特征之一[8]，誘導腫瘤細胞凋亡是有最有效的化療策略[9,10]。細胞凋亡通常由內源和外源兩種途徑來介導[11,12]。在內源性途徑中，Bax蛋白家族激活，作用于線粒體膜，細胞色素C釋放，導致細胞凋亡[13～16]。抑癌基因P53的作用是增加Bax蛋白的表達從而啟動內源性細胞凋亡途徑[17]；通過Bcl蛋白家族導致Caspase通路激活，啟動細胞凋亡。PARP可以結合DNA斷端并修復DNA損傷，其也是Caspase作用的底物。Caspase激活后，PARP被剪切并產生PARP 89 kD片段，失去結合并修復損傷DNA的功能。剪切型PARP在細胞內表達上調，表明細胞凋亡過程已經啟動，同時細胞的自身修復機制被抑制。

現有研究證明，白藜蘆醇對白血病、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[18,19]。然而，鮮見白藜蘆醇誘導前列腺癌細胞凋亡的報道，其誘導凋亡的分子機制也尚未闡明。為明確白藜蘆醇的抗前列腺癌效應及其可能的分子機制，我們首先觀察了白藜蘆醇對PC-3細胞增殖的影響，結果顯示，對照組及實驗1、2、3、4組OD值依次遞減，實驗1、2、3、4組細胞增殖抑制率依次遞增，表明白藜蘆醇在處理24 h后對PC-3細胞具有顯著的細胞毒作用，以劑量依賴性方式抑制PC-3細胞增殖。由于腫瘤細胞凋亡誘導是抗癌作用的主要觀察指標[20]，為明確PC-3細胞增殖率的降低是否歸因于細胞凋亡，我們又觀察了白藜蘆醇處理后細胞凋亡率變化，發現對照組及實驗1、2、3、4組細胞凋亡率依次遞增，說明白藜蘆醇可能是通過誘導細胞凋亡來抑制PC-3細胞的增殖活力。

線粒體途徑和死亡受體途徑是化療誘導腫瘤細胞凋亡的兩個主要途徑[21]。在線粒體途徑中，抑癌基因P53起著至關重要的作用。本研究結果顯示，實驗1、2、3、4組細胞中P53、PARP(89 kD)相對表達量高于對照組，實驗2、3、4組細胞中Cleave-Caspase-3相對表達量高于對照組，實驗1、2、3、4組細胞中P53、PARP(89 kD)、Cleave-Caspase-3相對表達量依次增高，表明白藜蘆醇處理PC-3細胞后P53、Cleave-Caspase-3蛋白表達水平上調，并加強PARP的片段切割。我們推測Caspase-3在PC-3細胞凋亡期間被激活，并通過作用于其底物PARP來促進細胞凋亡。

結合上述研究結果，我們認為，白藜蘆醇可抑制PC-3細胞增殖并誘導細胞凋亡，作用呈劑量依賴性，凋亡誘導機制可能與P53表達上調、Caspase-3被激活、增加PARP的剪切有關。本研究結果為白藜蘆醇用于前列腺癌的治療提供了實驗基礎。

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