急性心肌梗死血漿標志代謝物及相關代謝通路的篩選

許文軒，李彤，張磊，連爍，稂與恒，胡曉旻，高文卿，寧萌

(1天津醫科大學三中心臨床學院，天津300000；2天津市第三中心醫院；3天津市人工細胞重點實驗室，衛生部人工細胞工程技術研究中心)

急性心肌梗死(AMI)是一種常見的心血管急癥，發病率呈逐漸升高趨勢[1]，早期發現和治療對改善AMI患者預后、降低病死率至關重要[2]。經皮冠狀動脈介入(PCI)術為經心導管技術疏通狹窄甚至閉塞的冠狀動脈從而改善心肌灌注的治療方法。但患者在經PCI治療后，仍有部分指標改變不明顯。同時，心肌梗死后并發癥也嚴重威脅著患者的生命。代謝組學能夠在特定的環境和時間條件下，定量檢測生物體內代謝物水平并分析其變化趨勢。本研究借助代謝組學方法，對PCI治療的AMI患者血漿代謝輪廓進行分析，篩選與AMI疾病過程高度相關的特征代謝物，以便進一步認識AMI的發生發展機制，探討特征代謝物的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年12月～2016年7月于天津市第三中心醫院住院并施行PCI術的AMI患者。所有入選患者必須至少符合以下3條標準中的2條：①缺血性胸痛病史；②心電圖動態演變；③AMI相關血清心肌標志物動態改變。排除心絞痛、主動脈夾層、急性心包炎、急性肺動脈栓塞、心肌炎及心肌病等；排除其他非冠狀動脈粥樣硬化造成的AMI；排除合并糖尿病、脂肪肝、肝硬化等對代謝造成較大影響的疾病及其他肝腎疾病者。本研究共選入AMI患者25例，男13例、女12例，年齡(65±15)歲，設為病例組。分別于PCI術前和術后1 d采集患者的血液標本。選擇在天津市第三中心醫院體檢中心體檢的健康志愿者26例納入對照組，其中男14例、女12例，年齡(67±13)歲。兩組一般資料比較見表1。兩組血液標本采集后經2 500 g離心，取血漿分裝，并于-80 ℃保存。本研究經天津市第三中心醫院倫理委員會批準，所有血液標本的采集和臨床資料收集均獲得受檢者本人知情同意。

表1 病例組與對照組血漿TG、CHO、LDL、HDL、Hs-CRP、BNP CK CK-MB水平比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與同組術后相比，#P<0.05。

1.2 血漿樣本處理及總離子色譜、質譜分析 取兩組解凍后的血漿標本200 μL，與600 μL甲醇溶液混合，于4 ℃靜置10 min。然后于4 ℃、10 000 g下離心30 min，提取上清液，經真空離心蒸干得到干粉。然后以200 μL的5%甲酸乙腈溶液重溶，經0.22 μm孔徑濾膜過濾后即得到待測樣品。采用基于超高效液相色譜與超高分辨生物質譜聯用(UPLC-MS)平臺進行血漿總離子色譜、質譜分析。參照張立等[3]方法，進入Accela超高效液相色譜系統分析。采用二元溶劑梯度洗脫方式。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈混合溶液。色譜洗脫過程15 min，進液量10 μL，流動相流速為200 μL/min，自動進樣器溫度為4 ℃，柱溫20 ℃。起始梯度為5%流動相B，持續2.5 min，至8.5 min線性增至95%，維持3 min后降回5%，維持2.5 min以平衡色譜柱。質譜系統為LTQ Orbitrap XL系統。選取正離子掃描模式。離子源電壓4.5 kV、錐孔電壓150 V、毛細管電壓30 V、去溶劑化溫度275 ℃、鞘氣流速30 arb(99.999%氮氣)、輔氣流速5 arb(99.999%氮氣)。數據采集貫穿色譜洗脫過程，采集范圍為質核比(m/z)50～1 000、質譜分辨率為100 000(FWHM全峰高半峰寬分辨率)。二級質譜檢測采用碰撞誘導解離模式(CID)，能量設定為35(標準化碰撞能量)，碰撞氣體為99.999%高純氦氣。

1.3 血漿代謝輪廓分析 將由UPLC-MS平臺得到的數據導入MZmine2.0系統進行數據前處理[4]。規則為提取離子色譜峰強度信噪比S/N>30、保留時間(RT)偏移不超過±0.1 min、m/z偏差不超過±0.02。按照如上規則對離子色譜峰進行識別、匹配及歸一化處理。將得到的數據導入SIMCA-P+12.0.1.0系統進行數據分析[5]。通過模式識別，構建得到主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判別(OPLS-DA)模型。

1.4 血漿標志代謝物及相關代謝通路篩選 根據離子對模型的貢獻度及置信區間，初步篩選潛在標志代謝離子。然后利用SPSS22.0軟件對所得變量進行配對樣本非參數檢驗。將部分特征性代謝離子通過與標準品的色譜峰、質譜峰進行比對得到鑒定結果。無標準品可供對比的特征性代謝離子參照文獻[6]方法進行鑒定：①將特征代謝離子的精確m/z值輸入HMDB(http://hmdb.ca/)數據庫，按照m/z偏差不超過0.01的原則、準確電荷數及與實驗條件相符的電離方式對篩查結果進行校驗，保留相符的鑒定結果；②特征離子經MS/MS掃描，將二級質譜圖與Mass Frontier6.0軟件自帶數據庫模擬的鑒定結果相比對，以比對偏差不超過20%為準。將篩選鑒定出的標志代謝物輸入MetaboAnalyst3.0數據庫，進行代謝通路分析。

2 結果

2.1 病例組與對照組血漿總離子流圖 采用UPLS-MS平臺獲取了病例組PCI手術前后及對照組的血漿總離子流圖(圖1)。由圖1中可看出，病例組術前、術后及對照組的色譜峰分布存在差異。根據前述數據處理方法，通過MZmine2.0軟件從76份樣本中共提取出384種代謝物離子及對應的色譜峰積分面積值。將所得數據導入SIMCA-P+12.0.1.0系統進行數據分析。

圖1 病例組與對照組血漿樣本總離子流圖

2.2 血漿代謝輪廓分析模型 經SIMCA-P+12.0.1.0系統分析，得到PCA模型(R2X=42.8%，Q2=9.99%)，共計6個主成分，見圖2。由圖中可看出，病例組手術前后和對照組的血漿成分有一定聚類趨勢。雖然趨勢并不十分明顯，但可以說明AMI是這一趨勢的主要影響因素。同時構建了OPLS-DA模型(R2X=68.6%，R2Y=88.1%，Q2=65.7%)，見圖3。各組間有明顯的聚類區分趨勢。其中Y軸方向上的趨勢變化反映了AMI患者PCI術后代謝輪廓轉向正常方向，說明AMI患者施行PCI手術是造成這一聚類趨勢的最主要因素。

圖2 病例組PCI手術前后血漿樣本PCA模型

圖3 病例組PCI手術前后血漿樣本OPLS-DA模型

2.3 血漿標志代謝物篩選結果 提取OPLS-DA模型評分VIP值大于1且可信區間不包含0的變量。將病例組術前與對照組數據進行非參數檢驗，共篩選出有統計學差異的代謝物8種，即溶血磷脂酰膽堿(LysoPC)類物質[18∶2(9Z,12Z)]、LysoPC(16∶0) 、LysoPC(18∶0)、LysoPC(P-16∶0)，溶血磷脂酸(LPA)類物質[0∶0/18∶1(9Z)]、孕烷三醇(Pregnanetriol)、N-軟脂酰基鞘氨醇(N-Palmitoylsphingosine)，神經酰胺類物質Cer(d18∶0/16∶0)，具體見表2。比較病例組手術前后上述8種特征性代謝物水平，發現LysoPC[18∶2(9Z,12Z)]、LysoPC(16∶0)、Pregnanetriol、LysoPC(P-16∶0)、N-Palmitoylsphingosine水平在患者PCI術后有所恢復。

表2 AMI患者特征代謝物鑒定結果

2.4 代謝物相關代謝通路分析 根據病例組術前與對照組的差異性代謝物，共篩查出與AMI相關的兩條代謝通路，為甘油磷脂代謝通路和甘油脂類代謝通路，其中甘油磷脂代謝通路差異性更為明顯。通過比對兩條代謝通路發現，在兩條代謝通路中存在一個共有的受到AMI影響的代謝物，即磷脂酸類物質1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphate。

3 討論

本研究利用代謝組學研究平臺及相關分析方法對AMI特征性代謝物進行了研究。研究對象主要為施行PCI的AMI患者。通過分析患者手術前后血漿代謝輪廓變化以及相關代謝產物恢復情況，尋找與AMI高度相關的代謝信息，并根據患者手術前后相關代謝物的恢復情況，對于術后的干預性治療提供參考。

本研究利用UPLC-MS平臺對血漿樣本進行了分析，構建了以模式識別技術為基礎的代謝輪廓聚類區分模型。由OPLS-DA模型的聚類區分趨勢可看出，AMI是造成這一趨勢的最主要原因。而且隨著冠狀動脈的再度開通，患者的血漿代謝輪廓與術前有明顯差異，并向對照組趨近，但仍與對照組存在一定差異。憑借代謝輪廓模型，可直觀地得到AMI患者PCI手術前后機體內小分子內源性物質的變化態勢，繼而分析相關代謝通路，對患者術后的干預性治療提供建議，為臨床診療提供新思路。

本研究篩選和鑒定出的特征性代謝物所涉及的代謝過程主要包括磷脂代謝、脂肪酸代謝及激素合成等。我們發現，AMI患者PCI術前血漿多種溶血磷脂酰膽堿水平與對照組有明顯差異，其中LysoPC[18∶2(9Z,12Z)]、LysoPC(P-16∶0)升高，可能與心肌細胞壞死、細胞膜崩解后大量入血有一定關系。LysoPC水平升高對機體危害巨大。相關研究發現，LysoPC參與多種機體內生理生化反應過程，其中包括血管內皮損傷與炎癥反應，并導致血管硬化[7]。同時，LysoPC在體內大量貯存會引起心肌細胞電生理紊亂，引發心律失常，影響心肌收縮功能[8]。臨床表現為AMI患者患病期間伴隨不同程度的心電生理信號紊亂，甚至發生室速或室顫等危急癥狀。本研究結果顯示，LysoPC[18∶2(9Z,12Z)]和LysoPC(P-16∶0)由于AMI的影響表現出一定的升高趨勢，隨著PCI手術的實施，上述兩種特征性代謝產物恢復至與對照組相近的水平，或有一定恢復趨勢。

另外，LysoPC(16∶0)、LysoPC(18∶0)呈現出下降趨勢，同時發現，磷脂酸類物質LPA[0∶0/18∶1(9Z)]亦在AMI患者術前組呈下降趨勢，這一變化應該與磷脂酸類物質引起的細胞外鈣離子內流動員效應有關[9]，同時也提示心肌收縮力下降[10]。隨著冠狀動脈的再度開通，LysoPC(16∶0)恢復至與對照組相近的水平，然而LysoPC(18∶0)和LPA[0∶0/18∶1(9Z)]仍然保持在與術前相近的低水平，此現象提醒臨床醫師及研究者應高度重視此兩種代謝產物的變化，可給予相關治療，改善患者預后。

神經酰胺(N-軟脂酰基鞘氨醇)是重要的信號轉導代謝產物。神經酰胺已被證實參與多種心血管功能的調節，包括心肌舒縮功能[11]、血管舒縮反應[12]及內皮功能[13～15]。總體來說，神經酰胺參與多種心血管疾病的發病過程[16～18]，只有極少數情況下起保護作用[19]。本研究結果顯示，AMI患者的血漿神經酰胺水平明顯低于對照組，考慮是由于低水平神經酰胺釋放進入血液循環，或神經酰胺磷酸化增加導致的，這一結果與Xu等[20]及Luan等[21]的研究一致。通過對比患者PCI手術前后代謝物水平發現，患者在經過PCI手術后，血漿中N-軟脂酰基鞘氨醇恢復到與對照組相近水平，而神經酰胺類物質Cer(d18∶0/16∶0)仍然維持在術前水平，提醒臨床醫師或可使用相關藥物使此類代謝物水平恢復正常，避免此類物質代謝紊亂造成不良后果。

孕烷三醇是17-α-羥孕酮的一種代謝產物，AMI患者術前孕烷三醇水平較對照組明顯升高，可在一定程度上反映患者體內羥孕酮升高。研究[22]表明，羥孕酮可降低體內HDL水平，上調低密度脂蛋白LDL水平。所以，孕烷三醇在一定程度上可提示冠心病或AMI的發生。我們通過對孕烷三醇手術前后水平統計分析發現，隨著患者冠狀動脈血流恢復，孕烷三醇的血漿水平亦得到恢復。

本研究通過對上述代謝產物進行鑒定，篩選出了與AMI相關的兩條代謝通路，即甘油磷脂代謝通路和甘油脂類代謝通路。在兩條代謝通路中存在一個共有的受到AMI影響的代謝物，即磷脂酸類物質1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphate，同時也是上述兩條代謝通路的交匯點。磷脂酸是一種具有生物活性的脂質，廣泛參與人體生理生化反應，如血小板聚集、平滑肌收縮、心肌舒縮等。提示廣大臨床醫師及研究者應提高對此類物質的重視。

總之，本研究從代謝通路、細胞信號傳導等層面對AMI進行了研究與分析，得到了AMI患者和健康人群的代謝譜差異，并篩選出與AMI高度相關的特征代謝物。這些特征代謝物隨著疾病進程所產生的變化多指向甘油磷脂類物質代謝通路異常，對這一通路進行深入研究有助于發現AMI新的治療靶點及高度相關的危險因子。同時，對比患者PCI手術前后的血漿代謝輪廓及代謝標志物，發現部分代謝物并未恢復正常，對這些特征性代謝物深入研究，分析其代謝通路，可為防止疾病復發、改善患者預后提供參考。

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