α-乳香酸灌胃對小鼠腎間質纖維化的防治作用及其機制探討

柳敏娜，劉天龍，劉利敏，楊振，段夢露，孫世仁

(第四軍醫大學西京醫院，西安710032)

腎小管間質纖維化是慢性腎臟疾病進展到終末期的共同病理過程[1]。相比腎小球及腎臟血管疾病，間質纖維化在腎單位功能損失中扮演重要角色[2]。轉化生長因子β1(TGF-β1)被認為是關鍵的促纖維化細胞因子，其主要通過激活下游Smad家族蛋白表達從而調控細胞外基質產生。因此，抑制TGF-β/Smad通路有助于緩解腎間質纖維化，保護腎功能[3]。大量研究[4,5]表明，中藥及其有效成分可通過抑制該通路發揮抗腎纖維化作用，延緩腎臟疾病進展。α-乳香酸是乳香藥材經過提取、分離、純化后的產物。前期研究發現，乳香酸可以通過抑制TGF-β/Smad通路逆轉血管纖維化[6]，提示乳香酸有潛在的抗腎纖維化作用。本研究分別以小鼠單側輸尿管結扎、腎小管上皮細胞缺氧處理模擬腎臟纖維化動物模型和細胞模型，觀察α-乳香酸對腎間質纖維化的防治作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞與主要材料 SPF級C57/BL雄性小鼠52只由第四軍醫大學實驗動物中心提供。人腎小管上皮細胞HK-2購自美國ATCC細胞庫。α-乳香酸(純度≥98%、批號20150306)購自寶雞辰光生物有限公司。尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(t-SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA蛋白定量試劑盒購自西安飛揚生物科技有限公司。兔抗α-SMA抗體、GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。兔抗TGF-β1、Smad2/3和Smad7抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司。

1.2 α-乳香酸對小鼠腎間質纖維化的防治作用觀察

1.2.1 腎間質纖維化誘導及α-乳香酸給藥方法 小鼠適應性喂養2周后，隨機分為假手術組、模型組和乳香酸組，每組14只。模型組和乳香酸組參照文獻[7]方法行單側輸尿管結扎(UUO)手術誘導腎間質纖維化：小鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，仰臥位固定，從左下側腹部縱切打開腹腔，分離左側輸尿管后在中段位置結扎，縫合腹腔。假手術組只分離輸尿管但不結扎，其余操作與模型組一致。造模后第1天乳香酸組用α-乳香酸60 mg/kg灌胃，連續給藥21 d。

1.2.2 血清腎功能相關指標檢測 給藥結束后麻醉大鼠，摘眼球取血。血液在常溫下3 000 r/min離心10 min獲得血清。根據試劑盒說明書檢測血清BUN、Scr、MDA和t-SOD。

1.2.3 腎臟組織病理觀察 小鼠麻醉后，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛灌注固定，取左側腎臟，放入4%多聚甲醛繼續固定48 h。隨后進行石蠟包埋、5 μm厚切片。各組組織切片分別進行HE染色和MASSON染色。參考文獻[8]進行腎小管間質損傷評分和間質纖維化評分。

1.2.4 腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA mRNA及蛋白檢測 取各組小鼠腎臟組織，提取總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。用10%的SDS-PAGE電泳膠分離蛋白，每個孔上樣量為10 μg。將膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別用抗TGF-β1抗體(1∶1 000)、α-SMA抗體(1∶1 000)、Smad2/3抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。二抗在室溫下孵育1 h，洗滌后用ECL發光液發光，用BIO-RAD凝膠成像分析系統進行曝光采集，用Image J軟件分析蛋白相對表達量。小鼠腎臟組織中的總RNA根據QIAGEN RNeasy Mini試劑盒操作說明提取。引物由Primer5.0軟件設計。TGF-β1上游引物序列為5′-TGGCCAGATCCTGTCCAAAC-3′，下游引物序列為5′-GCGGGTGACCTCTTTAGCAT-3′；Smad2上游引物序列為5′-TCGGCACACGGAGATTCTAAC-3′，下游引物序列為5′-ACCAGAATGCAGGTTCCGAG-3′；Smad3上游引物序列為5′-CCGTGGAACTTACAAGGCGAC-3′，下游引物序列為5′-GGCAGCAAATTCCTGGTTGT-3′；Smad7上游引物序列為5′-TCTCAAACCAACTGGCTGTCC-3′，下游引物序列為5′-AGAGCCTCCCCACGCGA-3′；α-SMA上游引物序列為5′-GTTTCTCGCACGTCTCCTCT-3′，下游引物序列為5′-CAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′；內參GAPDH上游引物序列為5′-AGGAGAGTGTTTCCTCGTCC-3′，下游引物序列為5′-ATGGGCTTCCCGTTGATGAC-3′。PCR反應條件為：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火31 s，72 ℃延伸40 s。共進行40個反應。

1.3 α-乳香酸對HK-2細胞的抗纖維化作用觀察 HK-2細胞復蘇后，在DMEM培養基中常規培養，培養條件為37 ℃、21% O2、5% CO2。將HK-2細胞分為對照組、實驗1組、實驗2組。實驗1、2組放入三氣培養箱中(37 ℃、1% O2、5% CO2)培養48 h。實驗2組缺氧處理前在培養基中加入25 μg/mL的α-乳香酸。培養48 h后采用Western blotting法檢測各組細胞中的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白，方法參考“1.2.4”。

2 結果

2.1 α-乳香酸對小鼠腎間質纖維化的防治作用

2.1.1 各組小鼠血清BUN、Scr、MDA水平比較 模型組小鼠血清BUN、Scr、MDA水平高于假手術組，SOD水平低于假手術組(P均<0.01)。乳香酸組小鼠血清BUN、Scr、MDA水平低于模型組，SOD水平高于模型組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠血清BUN、Scr、SOD、MDA水平比較

注：與假手術組相比，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05；與模型組相比，##P<0.01。

2.1.2 各組小鼠腎臟組織病理變化 HE結果顯示，假手術組小鼠腎臟組織未見明顯病理改變。模型組腎小管上皮細胞萎縮、排列錯亂，正常結構消失，腎小球硬化，腎小管管腔擴張，間質纖維組織增生，有明顯炎癥細胞浸潤。模型組、假手術組、乳香酸組腎小管間質損傷評分分別為(8.66±1.22)、(0.65±0.18)、(5.21±1.03)分，模型組腎小管間質損傷評分高于假手術組，乳香酸組低于模型組(P均<0.05)。MASSON染色結果顯示，假手術組小鼠腎小管上皮細胞排列整齊，膠原染色主要集中在小管基底膜、腎小球系膜及毛細血管周圍，小管周圍間質無染色。模型組腎小管間質可見大量藍色膠原沉積，間質纖維組織增生；乳香酸組腎小管間質纖維化程度較模型組明顯減輕。模型組、假手術組、乳香酸組間質纖維化評分分別為(2.98±0.43)、(0.26±0.13)、(1.74±0.27)分，模型組間質纖維化評分高于假手術組，乳香酸組間質纖維化評分低于模型組(P均<0.05)。詳見圖1。

注：A為HE染色結果；B為MASSON染色結果。

圖1各組小鼠腎臟組織病理變化

2.1.3 各組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA mRNA及蛋白表達比較 模型組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相對表達量高于假手術組，Smad7 mRNA及蛋白相對表達量低于假手術組(P均<0.05)。乳香酸組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相對表達量低于模型組，Smad7 mRNA及蛋白相對表達量高于模型組(P均<0.05)。見圖2、表2。

2.2 α-乳香酸對HK-2細胞的抗纖維化作用 實驗1組細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA相對表達量高于對照組，Smad7相對表達量低于對照組(P均<0.05)；實驗2組TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA相對表達量低于實驗1組，Smad7相對表達量高于實驗1組(P均<0.05)。見圖3、表3。

3 討論

腎間質纖維化是導致終末期腎病的主要病理機制，可進展為腎衰竭而危及生命[9]。近年來，中藥在腎間質纖維化的治療上效果顯著。前期研究表明，乳香酸有很好的抗纖維化作用[6]，但乳香酸對腎間質纖維化的治療作用未見報道。本文擬對乳香酸的主要成分之一α-乳香酸對腎臟纖維化的防治作用進行研究，并進一步探討機制。預實驗首先確定了α-乳香酸對小鼠和HK-2細胞抗腎臟纖維化的最佳藥物濃度分別為60 mg/kg和25 μg/mL。

圖2 各組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表達情況

圖3 各組細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表達情況

組別TGF?β1mRNA蛋白Smad2mRNA蛋白Smad3mRNA蛋白Smad7mRNA蛋白α?SMAmRNA蛋白假手術組1．01±0．280．92±0．091．07±0．171．03±0．141．04±0．210．99±0．181．11±0．141．02±0．180．95±0．221．09±0．23模型組4．51±0．99??3．77±1．05??2．84±0．38?1．96±0．22?2．86±0．75?3．55±1．01??0．54±0．19?0．36±0．12??3．17±0．62??2．99±0．43??乳香酸組2．91±0．47#1．84±0．32#1．77±0．32#1．37±0．18#1．79±0．24#2．71±0．63#0．85±0．14#0．69±0．13#1．89±0．35#1．60±0．26##

注：與假手術組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。

表3 各組細胞中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7、α-SMA蛋白表達比較

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與實驗1組相比，#P<0.05。

我們先觀察了α-乳香酸對小鼠腎間質纖維化的防治作用。Scr和BUN是反映腎功能的常用指標，二者水平增高與腎臟疾病進展呈正相關[10]。當體內MDA水平增高、SOD活性下降時，機體氧化應激增強，而抗氧化能力減弱，最終導致腎組織損傷。本研究結果顯示，模型小鼠在輸尿管結扎手術21 d后，血清Scr、BUN水平顯著升高，表明手術成功誘導了小鼠腎功能損傷；同時血清MDA水平增高、SOD活力降低，表明造模后小鼠體內氧化應激水平升高。而乳香酸組小鼠經α-乳香酸治療后，血清Scr、BUN、MDA水平降低，SOD活力增高，提示α-乳香酸具有腎保護作用。同時，各組小鼠腎臟組織病理檢查結果顯示，模型組小鼠腎小管變形，可見明顯水腫和炎癥細胞浸潤，間質周圍膠原沉積顯著，表明模型組小鼠發生腎纖維化病理改變。而給予α-乳香酸灌胃后，腎臟病理結構變化有顯著改善，腎小管間質損傷和間質纖維化程度減輕，表明α-乳香酸有抗腎臟纖維化的作用。

為了進一步探究α-乳香酸抗纖維化的作用機制，我們觀察了各組小鼠腎臟組織中纖維化相關分子的表達變化。TGF-β1參與誘導腎臟纖維化的多個環節，是重要的促纖維化因子[11]?；罨腡GF-β1可調控細胞分化、增殖、遷移及細胞外基質表達。大量研究表明，在與間質纖維化相關的腎臟疾病中，TGF-β1表達都顯著升高[12,13]。而抑制TGF-β1的生物活性可減緩纖維化進程[14]。本研究中，模型組腎臟組織中TGF-β1mRNA及蛋白表達水平升高，給藥后顯著下降，提示α-乳香酸可通過抑制TGF-β1的表達起到抗腎臟纖維化的作用。

Smad家族是TGF-β誘導的纖維化過程中關鍵的下游調節因子，在TGF-β的刺激下，Smad2和Smad3發生磷酸化，進入核內調控靶基因轉錄[15]。研究表明，慢性腎臟病樣本中Smad2、Smad3水平較正常組織高[16]，抑制二者表達可有效緩解纖維化[17]。Smad7是一種抑制型Smad蛋白，通過負反饋調節TGF-β1，抑制Smad2和Smad3的磷酸化。Smad7的過表達可抑制TGF-β/Smad通路，延緩腎臟纖維化的進展[18]。α-SMA是肌成纖維細胞的特征分子，在TGF-β的刺激下，α-SMA表達升高，成纖維細胞大量增生[19]。本研究結果顯示，模型組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相對表達量高于假手術組，Smad7 mRNA及蛋白相對表達量低于假手術組；乳香酸組小鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、α-SMA mRNA及蛋白相對表達量低于模型組，Smad7 mRNA及蛋白相對表達量高于模型組。這提示α-乳香酸可阻斷TGF-β/Smad通路激活，進而發揮抗腎纖維化作用。

腎小管間質慢性缺氧是促進各種慢性腎臟病進展至終末期的共同機制[20]。HK-2細胞缺氧處理是體外模擬腎間質纖維化的經典方法[21]。在本實驗中，HK-2細胞經過缺氧處理后，細胞內α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、表達升高，Smad7表達下調，給予α-乳香酸處理后，這些蛋白表達發生逆轉，與小鼠體內實驗結果一致。上述結果表明α-乳香酸對腎纖維化的防治作用可能是通過下調TGF-β1、α-SMA表達和抑制Smad2、Smad3活化來實現的。

綜上所述，α-乳香酸對小鼠腎間質纖維化有防治作用，機制可能與抑制TGF-β/Smad通路有關。

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