中國漢族家系痛風患者β3腎上腺素受體基因突變觀察

孫雅奇，劉世國，賀玉偉，李長貴

(青島大學附屬醫院，山東青島266071)

痛風是長期嘌呤代謝障礙、血尿酸增高引起組織損傷的一組異質性疾病，以劇烈疼痛、急慢性關節炎、痛風石為臨床特征[1]。遺傳因素是痛風發病的關鍵因素[2]。研究[3]表明，10%～30%的原發性痛風患者有痛風家族史，家系痛風(除先證者外，該家系三代以內直系親屬還有1例及以上痛風患者)與散發痛風在遺傳機制上存在差異，但目前相關研究多基于散發病例，國內外關于家系痛風易感基因的研究較少。β3腎上腺素受體(ADRB3)主要表達于脂肪組織[4]，多種族大量人群的橫斷面研究與病例對照試驗均提示ADRB3基因是高尿酸血癥和痛風形成的易感基因[5～8]。但是目前國內外開展的ADRB3基因與痛風和高尿酸血癥遺傳易感性的研究中，研究對象均為散發痛風患者。為明確ADRB3基因與家系痛風遺傳易感性的關系，本課題組對中國漢族家系痛風患者進行ADRB3基因突變篩查。

1 資料與方法

1.1 研究對象 在山東省痛風病臨床醫學中心已建立的痛風遺傳資源庫中，收集500例來自不同家系的家系痛風先證者(病例組)及500例與痛風家系無關的正常人(對照組)。以上人群均接受內分泌代謝病?？漆t生的病史采集和體格檢查，檢測所有研究對象的空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇及血尿酸等指標。痛風診斷均符合美國風濕病協會(ACR)診斷標準和2015ACR/EULAR制訂的痛風分類診斷標準[9,10]。500例正常對照納入標準為：血尿酸水平<360 μmol/L；無痛風發作史；與痛風家系無關；排除影響尿酸代謝及排泄的疾病如血液系統疾病、慢性腎病、高血壓等；排除應用影響尿酸水平的藥物如氫氯噻嗪、阿司匹林、替米沙坦等。兩組研究對象均為中國漢族人群。本研究已獲青島大學醫學院醫學倫理委員會審批通過。所有參與者已知曉本研究的相關情況，并簽署知情同意書。

1.2 ADRB3基因突變篩查方法 采用DNA提取標準試劑盒提取兩組外周血基因組DNA。用Nanodrop超微量分光光度計檢測提取DNA的濃度和純度。采用Primer5.0軟件設計引物擴增ADRB3所有外顯子，由上海英濰捷基公司合成引物，引物序列見表1。PCR反應體系及擴增條件參考文獻[11]。將PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Bio-Rad凝膠成像儀進行圖像掃描，于相應位置處可見單一清晰條帶。PCR產物送至北京擎科生物有限公司進行直接測序。采用Chromas2.21軟件查看峰圖文件。以GenBank中ADRB3基因外顯子序列(NM000025.2)為參照序列，用DNAMAN軟件對序列進行比對分析。所有突變位點均進行反向測序驗證。將發現的突變位點在常用基因變異數據庫(dbSNP、1000genomics、ESP6500、UniProt、ClinVar)中進行比對。新發突變按照HGVS國際規范進行命名[12]。

表1 ADRB3基因外顯子片段引物序列

1.3 ADRB3基因突變先證者家系調查 對攜帶ADRB3基因突變的家系痛風先證者所在家系成員進行調查。家系中三代以內直系親屬均接受內分泌代謝病?？漆t生的病史采集、體格檢查、外周血樣本采集和血生化檢查。家系外周血樣本均提取DNA，進行PCR擴增，對ADRB3基因外顯子測序并分析。

2 結果

2例家系痛風先證者ADRB3基因3′-非翻譯區(UTR)存在雜合突變c.*660C>T，即ADRB3基因3′-UTR第660位堿基存在C>T的雜合性突變。該突變在對照組中不存在，常用基因變異數據庫如dbSNP、1000genomics、ESP6500、UniProt、ClinVar中未發現此突變，國內外研究也未見報道，為新發突變?；蛲蛔兗罢y序峰圖見圖1。

1例攜帶ADRB3 c.*660C>T突變的先證者所屬家系共11例家系成員中，5例為痛風患者。通過家系系譜圖(圖2)分析該家系痛風的遺傳特征：每代均有痛風患者，父母中有痛風患者則子女有50%概率發病，父母中無痛風患者則子女無人患病。男女發病機會均等，該家系痛風符合常染色體顯性遺傳。該家系中5例痛風患者均攜帶ADRB3 c.*660C>T突變，而非痛風患者不攜帶此突變，基因型與表型共分離。5例痛風患者測序峰圖見圖3。該家系痛風患者臨床資料見表2。Ⅲ2為先證者，20歲，18歲發病，血尿酸665 μmol/L(正常值為<420 μmol/L)，首發關節為足背部，并累及第一跖趾關節和踝關節；查體身高192 cm，體質量110 kg，BMI 29.8 kg/m2；血壓、空腹血糖、甘油三酯、膽固醇均未發現異常。所有痛風患者血尿酸498～694(595±75)μmol/L，明顯高于正常。非痛風患者血尿酸水平正常。5例痛風患者查體BMI (27.9±1.7)kg/m2、空腹血糖(7.1±0.9)mmol/L、甘油三酯(3.28±1.77)mmol/L、血膽固醇(5.21±0.81)mmol/L，其中合并肥胖、糖尿病、高血壓各3例。見表2。

另外1例攜帶ADRB3 c.*660C>T突變的先證者37歲，就診時首次發病，第一跖趾關節疼痛、腫脹、關節發紅，血尿酸434 μmol/L；所屬家系中僅其祖父為痛風患者，已去世，未獲得其血液樣本；該家系其他成員拒絕參加本研究。

注：A、B分別為2例家系痛風先證者ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T峰圖，箭頭所指處為雜合突變；C為不攜帶該突變的正常對照測序峰圖，箭頭所示無突變。

圖12例家系痛風先證者ADRB3基因3′-UTR雜合突變示意圖

圖2 攜帶ADRB3 c.*660C>T突變的痛風家系系譜圖(箭頭所指為先證者)

注：箭頭所指為ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T。

圖3攜帶ADRB3c.*660C>T突變的1例痛風家系中5例痛風患者ADRB3基因突變示意圖

3 討論

痛風是多基因遺傳病，其發病是環境因素與多個易感基因共同作用的結果[13]。多項研究顯示ADRB3基因是高尿酸血癥和痛風形成的易感基因[5～8]。Wang等[5]對中國漢族男性421例痛風患者和312例正常人進行病例對照研究，結果顯示rs4994(Trp64Arg)位點與中國漢族男性痛風呈強相關，Arg64等位基因攜帶者患痛風的風險顯著增加，提示ADRB3基因是中國漢族男性痛風的易感基因。有學者[7]對新西蘭人群進行研究發現，ADRB3基因rs4994(Trp64Arg)位點在校正腎臟疾病的影響后與痛風存在關聯性。Huang等[6]發現rs4994(Trp64Arg)位點與高尿酸血癥呈強相關，Arg64等位基因攜帶者患高尿酸血癥的風險顯著增加。但以上研究對象均為散發痛風患者。目前國內外未見ADRB3基因與家系痛風遺傳易感性之間的報道。

表2 攜帶ADRB3 c.*660C>T突變的1例痛風家系中5例痛風患者臨床資料

本研究選擇山東省痛風病臨床醫學中心痛風遺傳資源庫收集的500例來自不同家系的家系痛風先證者，以及500例與以上家系無關的正常對照，選擇中國漢族原發性痛風易感基因ADRB3外顯子進行測序，發現2例家系痛風先證者存在ADRB3基因3′-UTR新發突變c.*660C>T。其中一個家系共三代11人，包括5例患者(男4例、女1例)，6例正常人。5例患者均攜帶ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T，而正常人不攜帶。該痛風家系具有自己的遺傳特點：每代均有痛風患者，男女發病機會均等。痛風好發于男性，發病高峰年齡在40～50歲[14]，而該家系平均發病年齡(31±11)歲，比散發患者發病早近10歲。第一代中Ⅰ1發病年齡50歲，第二代中Ⅱ1、Ⅱ3發病年齡分別為35、31歲，第三代中Ⅲ1、Ⅲ2發病年齡分別為22、18歲，每一代痛風患者發病年齡均比上一代提前。臨床研究發現，95%痛風患者是男性，女性發病多在絕經期后，而女性患者Ⅱ3發病時31歲，屬絕經期前發病[14]。綜上，該家系是典型的常染色體顯性遺傳家系，基因型與表型共分離，呈現遺傳早現現象，可能為單基因遺傳模式，新發罕見ADRB3 c.*660C>T突變可能是該家系的致病突變。

人ADRB3基因位于染色體8p12-p11.2，全長3 672 bp，3′端非編碼區共1 224 bp[3]。Traget Scan和PicTar軟件預測有11種miRNA能與ADRB3基因3′-UTR結合，即let-7d-5p、let-7g-5p、let-7e-5p、miR-98-5p、let-7i-5p、miR-4500、let-7b-5p、let-7a-5p、let-7f-5p、let-7c-5p。ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T并不位于上述11種miRNA與ADRB3基因3′-UTR的結合區域內，推測c.*660C>T突變可能通過影響miRNA與ADRB3基因3′-UTR結合或結合后形成空間構象從而導致ADRB3基因異常表達[15]。功能研究證實，β3腎上腺素受體功能下降可引起脂肪組織中脂肪分解減少和脂肪酸氧化下降，導致脂肪沉積、血游離脂肪酸升高、脂肪細胞分泌TNF-α增多，導致肥胖、胰島素抵抗[16]。在胰島素抵抗狀態下，3-磷酸甘油脫氫酶活性降低，糖酵解過程的中間產物向5-磷酸核糖及磷酸核糖焦磷酸轉移，導致血尿酸生成增多[17]。此外，胰島素抵抗狀態可引起繼發性高胰島素血癥，高水平的胰島素及胰島素前體物可刺激腎小管Na+-H+交換，增加H+排泌的同時使尿酸重吸收增多；還可以通過影響近端腎小管尿鈉排泄而競爭性抑制尿酸的排泄，使血尿酸升高，從而引起痛風性關節炎的發生[18]。本研究中，5例攜帶ADRB3基因c.*660C>T突變的家系痛風患者中合并肥胖、糖尿病各3例，血生化檢查空腹血糖、甘油三酯、膽固醇水平高于正常。結合基因型與表型，我們推測ADRB3基因3′-UTR c.*660C>T可能影響miRNA與ADRB3基因3′-UTR結合，形成空間構象，導致β3腎上腺素受體功能下降，出現肥胖、胰島素抵抗，影響腎尿酸排泄進而導致高尿酸血癥，引起痛風性關節炎。

綜上，本研究發現2個中國漢族原發性痛風家系中存在ADRB3基因3′-UTR新發雜合突變c.*660C>T。該突變可能是其中一個家系的致病突變，但具體致病機制還需進一步研究。

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