缺氧誘導(dǎo)因子抑制劑YC-1對(duì)缺氧肝癌細(xì)胞生物鐘基因和蛋白表達(dá)及增殖的影響

許靜，孫誠誼，喻超，何曉曉，楊盛力

(1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴陽550000；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院)

生物鐘是生物體生命活動(dòng)的內(nèi)在節(jié)律，在長遠(yuǎn)的進(jìn)化過程中已趨于穩(wěn)定。生物鐘主要由Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε、Clock、BMAL1、NPAS2和Rev-Erbα等基因調(diào)控[1，2]。生物鐘基因表達(dá)異常可導(dǎo)致生物節(jié)律紊亂，影響細(xì)胞生長、代謝和損傷修復(fù)，并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[3]。如Per1、Per2、Per3、Bmal1等通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤的發(fā)生；Clock則促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[4～7]。腫瘤最突出的特性之一即生長快速，隨著細(xì)胞數(shù)量、體積的快速增加，腫瘤內(nèi)部的血液供應(yīng)相對(duì)不足，形成缺氧微環(huán)境[8，9]。缺氧信號(hào)通路阻斷劑YC-1由人工合成，可抑制低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)的表達(dá)，并抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用[10～12]。在腫瘤組織中，普遍存在著生物鐘基因表達(dá)異常。肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與生物鐘表達(dá)紊亂亦關(guān)系密切[13]。然而目前對(duì)于生物鐘基因表達(dá)變化與肝癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)缺氧微環(huán)境可引起肝癌細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)紊亂[14]。本研究中，我們將通過三氣培養(yǎng)箱模擬體內(nèi)缺氧微環(huán)境，觀察YC-1對(duì)缺氧肝癌細(xì)胞中生物鐘基因、蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步探索生物鐘基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清購于美國Hyclone公司。PCR引物購于Invitrogen公司。RNA提取試劑TRIzol、PCR試劑SYBR Green PCR Master Mix及PCR引物合成由Life公司提供。鼠抗人Cry1單克隆抗體、兔抗人Cry2多克隆抗體、兔抗人Clock多克隆抗體、兔抗人Bmal1多克隆抗體均購于Abcam公司。鼠抗人β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司。鼠抗人Per1、Per2、Per3多克隆抗體由Novus公司提供。

1.2 YC-1對(duì)缺氧肝癌細(xì)胞生物鐘基因和蛋白表達(dá)的影響觀察

1.2.1 Huh7細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將肝癌細(xì)胞Huh7接種于6孔板中，置于缺氧培養(yǎng)箱中，按氧氣1%、氮?dú)?4%、二氧化碳25%的比例持續(xù)通入氣體，待Huh7細(xì)胞生長至75%融合時(shí)，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，分別加入等量的DMSO和50 μmol/L的YC-1。

1.2.2 Huh7細(xì)胞中生物鐘基因檢測(cè) 采用real-time PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1 mRNA。兩組于培養(yǎng)48 h后用TRIzol試劑提取出RNA，測(cè)量提取RNA的濃度及純度，取等量RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Green Mix 10 μL、cDNA模板1.5 μL、10 μmol/L的上游和下游引物各1 μL、ddH2O 6.5 μL。以β-actin為內(nèi)參。生物鐘基因及內(nèi)參基因引物序列見表1。以2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 生物鐘基因及內(nèi)參基因引物序列

1.2.3 Huh7細(xì)胞中生物鐘基因蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)兩組細(xì)胞中的Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1蛋白。提取兩組細(xì)胞總蛋白，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉2 h后，孵育一抗、二抗，ECL法顯色，計(jì)算機(jī)掃描蛋白質(zhì)條帶后進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

監(jiān)測(cè)點(diǎn)的布設(shè)是環(huán)境監(jiān)測(cè)質(zhì)量保證過程中最為關(guān)鍵的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，決定了樣品的代表性。大氣監(jiān)測(cè)樣點(diǎn)在污染源分散的情況下，采用網(wǎng)格布點(diǎn)法、功能區(qū)布點(diǎn)法、同心圓布點(diǎn)法或扇形布點(diǎn)法等。在實(shí)際工作中，為達(dá)到因地制宜，往往采取以一種布點(diǎn)方法為主，兼用其他方法的綜合布點(diǎn)法。對(duì)于某一河段的監(jiān)測(cè)，一般只需設(shè)置對(duì)照、控制和消解三種斷面，再根據(jù)水面的深度和寬度確定具體的采樣點(diǎn)。例如，當(dāng)水面寬度不大于50 m時(shí)，只設(shè)一個(gè)中泓垂線；在一條垂線上，當(dāng)水深不大于5 m時(shí)，只在水面下0.5 m處設(shè)一個(gè)采樣點(diǎn)。

[14] Bhatti P, Cushing-Haugen KL, Wicklund KG, et al. Nightshift work and risk of ovarian cancer[J]. Occup Environ Med, 2013,70(4):231-237.

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Clock、Per1、Per3、Cry1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，Bmal1、Per2、Cry2 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 兩組細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)比較

2.2 兩組細(xì)胞中生物鐘基因蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Clock、Per1、Per3、Cry1蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，Bmal1、Per2、Cry2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見表3、圖1。

表3 兩組細(xì)胞中生物鐘基因蛋白表達(dá)比較

圖1 兩組細(xì)胞中Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1蛋白表達(dá)情況

2.3 兩組細(xì)胞克隆形成情況比較 實(shí)驗(yàn)組克隆形成個(gè)數(shù)為83個(gè)、克隆形成率為27.67%，對(duì)照組分別為191個(gè)、63.67%，實(shí)驗(yàn)組克隆形成個(gè)數(shù)及克隆形成率均低于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見圖2。

3 討論

筆者結(jié)合微課有關(guān)特點(diǎn)，按照課堂教學(xué)內(nèi)容與形式，分門別類將不同教學(xué)內(nèi)容與微課進(jìn)行整合，促進(jìn)微課教學(xué)根植于課堂教學(xué)之中。

圖2 兩組細(xì)胞克隆形成情況

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2誘導(dǎo)的缺氧條件可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)改變，表明缺氧可導(dǎo)致生物鐘基因表達(dá)異常[18]。YC-1由人工合成，是HIF-1α的阻滯劑，其作用機(jī)制是抑制HIF-1α的表達(dá)并誘導(dǎo)缺氧依賴性細(xì)胞的特異性凋亡，同時(shí)產(chǎn)生活性氧簇(ROS)，從而將無氧的糖酵解轉(zhuǎn)化為有氧的氧化磷酸化；若加入葡萄糖和胰島素，能使YC-1特異性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的ROS量增加，從而增強(qiáng)抑制腫瘤生長的功能[11，12]。

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參考文獻(xiàn)：

結(jié)合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為，YC-1作用后，缺氧環(huán)境下的肝癌細(xì)胞中Clock、Per1、Per3、Cry1基因及蛋白表達(dá)下調(diào)，Bmal1、Per2、Cry2基因及蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞增殖和克隆形成能力減弱。YC-1雖然不能完全逆轉(zhuǎn)缺氧對(duì)肝癌細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)的影響，但其可抑制肝癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用。借鑒YC-1聯(lián)合低劑量胰島素和葡萄糖增強(qiáng)抗腫瘤作用的研究成果[11,19,20]，可考慮尋找其他能影響肝癌細(xì)胞生物鐘基因表達(dá)的因子，與YC-1協(xié)同作用，共同遏制腫瘤的生長。

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他給馬云寫信，倡議淘寶大學(xué)給宗教人士免費(fèi)開課，并許諾自己將創(chuàng)造一個(gè)奇跡，“人生出一次家，是多么的重要。要把出家與還俗，看成是在淘寶上開店與關(guān)門一樣簡(jiǎn)單與順理成章。那么我們的人生就更容易看破放下。”

邢雙雙等[8]認(rèn)為護(hù)理質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)體系應(yīng)覆蓋臨床常見病和多發(fā)病，應(yīng)利于臨床專科使用，應(yīng)明確各個(gè)指標(biāo)的界定標(biāo)準(zhǔn)。本研究指標(biāo)體系包括15項(xiàng)安全及消毒隔離敏感指標(biāo)，9項(xiàng)護(hù)理記錄及評(píng)估敏感指標(biāo)，12項(xiàng)醫(yī)囑執(zhí)行及服務(wù)流程敏感指標(biāo)，3項(xiàng)輸血專項(xiàng)敏感指標(biāo)，內(nèi)容涵蓋護(hù)理質(zhì)量過程和結(jié)局，適宜各類病人使用及臨床各護(hù)理單元的護(hù)理質(zhì)量管理。

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為使研究結(jié)果更具嚴(yán)謹(jǐn)性，以及盡可能減少其他變量的影響，本研究所用的肝癌細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期，避免了部分細(xì)胞衰老等自身因素對(duì)基因表達(dá)的影響。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中Clock、Per1、Per3、Cry1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，Bmal1、Per2、Cry2 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示缺氧信號(hào)通路阻斷劑YC-1僅能影響肝癌細(xì)胞由缺氧引起的部分生物鐘基因的表達(dá)紊亂，而不能起到完全逆轉(zhuǎn)的作用。為研究YC-1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響，我們進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，經(jīng)YC-1作用后，實(shí)驗(yàn)組克隆形成率明顯降低，表明YC-1能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖。然而克隆形成率只能宏觀地顯示細(xì)胞增殖的多與少，而不能解釋影響細(xì)胞增殖的機(jī)制，這是本研究的局限所在。

富馬酸喹硫平是一種新型二苯氧氮雜卓類的多種神經(jīng)遞質(zhì)受體拮抗劑，對(duì)于5‐HT2、D1、D2、H1與α1受體均具有較高親和力，主要用于精神分裂癥、情感障礙和抑郁癥的治療，臨床不良反應(yīng)發(fā)生率較少，目前富馬酸喹硫平已成為精神分裂癥與雙向情感障礙及抑郁癥治療的一線用藥［1‐3］，中國精神分裂癥防治指南（2007版）將其作為臨床一線藥物進(jìn)行推薦。

隨著科學(xué)的發(fā)展，生物鐘逐漸走入人們的視野，其對(duì)晝夜節(jié)律的干擾、對(duì)內(nèi)分泌性疾病的促進(jìn)，以及在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中的重要作用正逐步被發(fā)現(xiàn)。生命的生物節(jié)律離不開生物鐘的調(diào)控，而生物鐘在分子水平上受多個(gè)生物鐘基因的共同影響，包括原癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)控因子、血管生成相關(guān)基因和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因等，如Per1、Per2、Per3、Clock、Bmal1、Cry1、Cry2、NPAS2、CKIε、Tim、Rev-Erb、DEC等[1，2]。越來越多的臨床數(shù)據(jù)表明，生物節(jié)律紊亂如夜間工作導(dǎo)致的晝夜節(jié)律紊亂，可使生物鐘基因表達(dá)紊亂，從而引發(fā)各種腫瘤如胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等[14～17]。研究[2]表明，對(duì)比癌旁正常組織，肝癌組織中Bmal1、NPAS2、DEC1高表達(dá)，Per1、Per2、Per3、Cry2則呈低水平表達(dá)，說明生物鐘基因的表達(dá)與肝癌密切相關(guān)。在肝癌組織中高表達(dá)而正常組織中低表達(dá)的基因可能為癌基因，在癌旁正常組織中高表達(dá)而癌組織中低表達(dá)的基因可能為抑癌基因，由此推測(cè)生物鐘基因的表達(dá)影響肝癌的發(fā)生與發(fā)展。同時(shí)有研究[18]表明，肝癌細(xì)胞中生物鐘基因的表達(dá)明顯受環(huán)境含氧條件的影響，在缺氧與常氧條件下的表達(dá)結(jié)果截然不同，較常氧條件，缺氧時(shí)Per1、Cry2、Bmal的表達(dá)水平升高，Cry1、Per2、Per3、CKIε、Clock的表達(dá)水平降低。但該變化趨勢(shì)與生物鐘基因在肝癌組織中的表達(dá)僅部分相同，表明還有其他因素影響肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

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地名詞典和測(cè)繪學(xué)敘詞表都不能稱之為地名本體，因?yàn)樗麄兌际且?guī)范化的說明，專業(yè)性較強(qiáng)，而地名本體需要構(gòu)建的是最廣泛的，最基本的地名概念性內(nèi)容，需要形式語言(Formal Language)的一般化描述。從使用目的上看，地名詞典和測(cè)繪學(xué)敘詞表都是檢索工具，是為了方便信息的查詢檢索，而地名本體則是為了表達(dá)地名的知識(shí)體系，并不僅僅是規(guī)范概念，其所表達(dá)的屬性內(nèi)容較地名詞典和敘詞表更加豐富。

1.3 YC-1對(duì)缺氧肝癌細(xì)胞增殖的影響觀察 取對(duì)數(shù)生長期的Huh7細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞后收集細(xì)胞，加入2個(gè)分別含10 mL預(yù)溫培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并將密度調(diào)整至300/皿。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入50 μmol/L的YC-1，對(duì)照組加入等量0.9%的NaCl溶液。在乏氧條件下(1% O2)培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)培養(yǎng)皿出現(xiàn)肉眼可見的克隆后，終止培養(yǎng)，棄上清，用PBS洗滌2次，并用5 mL的醋酸、甲醇液(1∶3)固定15 min，然后用Giemsa染色10 min。計(jì)數(shù)克隆數(shù)目，計(jì)算克隆形成率，克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

首先，東博會(huì)的品牌發(fā)展還不是特別成熟。近十多年來，隨著南寧東博會(huì)的成功舉辦，南寧的會(huì)展業(yè)走上了一條高速發(fā)展的道路。但由于南寧經(jīng)濟(jì)底子薄，人才吸引力度薄弱，和其他省份相比，我們的會(huì)展業(yè)還不夠成熟。東博會(huì)相比周邊的廣交會(huì)等大型展覽會(huì)，實(shí)力相差較大，導(dǎo)致其吸引力不強(qiáng)，影響來參加展會(huì)的人員數(shù)量和質(zhì)量，在一定程度上也影響其會(huì)展旅游以及南寧的整體旅游。

若圖像中存在撒料區(qū)域，則使用區(qū)域生長算法對(duì)紅外圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行撒料區(qū)域分割，它將具有某種相似性質(zhì)的像素或體集合起來構(gòu)成區(qū)域.其基本思想是，在檢測(cè)區(qū)域中設(shè)置一個(gè)種子作為生長種子，在種子周圍搜索符合約束條件的種子，將其合并到種子點(diǎn)像素的集合.不斷重復(fù)上述過程，直到?jīng)]有符合約束條件的像素[13-14].其中約束條件是式8：

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(1) 梯度比Gr值測(cè)定。排水管淤塞試驗(yàn)在梯度比滲透儀上進(jìn)行，其原理是通過測(cè)定滲透24 h后土工織物及其上25 mm厚土層的水力梯度i1以及土工織物上部25 mm至75 mm這段土層的水力梯度i2，按照下式求出梯度比Gr值：

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纖維素酶活力單位：在37℃，pH值5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。

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