miR-381在腎癌細胞中的表達變化及其對細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響

梁穎瑩，莫志文，黃宇帆，邵汛帆，袁亞維

(廣州醫科大學附屬腫瘤醫院，廣州510030)

腎細胞癌(腎癌)是常見的泌尿系統惡性腫瘤之一[1]。腎癌治療方法包括手術及免疫治療，但復發和轉移仍是威脅患者生命的重要原因，進展期患者5年生存率不到10%[2]。因此，深入研究腎癌發病機制，對提高腎癌診治水平具有重要意義。miRNA不編碼蛋白質，可通過與靶標基因3′-UTR端的序列結合從而沉默基因表達[3]。現已發現多種腫瘤中miRNA表達異常，且miRNA可通過影響細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡從而參與腫瘤的發生發展[4]。研究[5,6]認為miRNA可作為多種腫瘤的臨床診斷、病理分型和預后的標志物。miR-381位于人14號染色體上，在多種腫瘤中表達下調，對腫瘤細胞的生長侵襲有抑制作用。有學者[7～9]報道miR-381可通過抑制ERK和AKT信號通路促進神經膠質瘤細胞增殖，其表達水平也與肺癌的預后不良呈負相關。關于miR-381在腎癌中的作用尚未見報道。本研究觀察了miR-381在腎癌細胞系中的表達變化，及其對腎癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 腎癌細胞系Caki-2、A498、786-O及人正常腎上皮細胞系HK-2均購自中山大學實驗動物中心細胞庫。胎牛血清及RPMI1640培養基購自美國Roswell公司。DNA結合抑制因子1(ID-1)及GAPDH一抗均購自美國BD公司，二抗購自美國Santa Cruz公司。miR-381 mimics及Scramble均由上海吉瑪生物科技有限公司合成。RT-PCR儀購自美國BD公司。HBS-1096B酶標儀購自南京德鐵實驗設備有限公司。蛋白免疫印跡電泳設備購自美國Bio-Rad公司。

1.2 腎癌細胞中miR-381檢測 Caki-2、A498、786-O細胞及HK-2細胞均種植于RPMI1640培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，48 h后消化傳代。采用qRT-PCR法檢測各細胞中的miR-381，以U6小核RNA作為內參，以2-ΔΔCt表示miR-381相對表達量。

1.3 miR-381表達變化后細胞增殖、遷移、侵襲能力觀察

1.3.1 Caki-2細胞分組及miR-381 mimics轉染方法 將Caki-2細胞分為miR-381組、NC組、mock組，miR-381組采用LipofectamineTM2000轉染miR-381 mimics，mock組轉染miR-381 Scramble，NC組不做轉染處理。miR-381 mimics上游引物序列為5′-UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU-3′，下游引物序列為5′-AGAGAGCUUGCCCUUGUAUAUU-3′。miR-381 Scramble上游引物序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游引物序列為5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。采用qRT-PCR法檢測各組細胞中的miR-381，miR-381組、NC組、mock組中miR-381相對表達量分別為8.950±0.720、1.000±0.003、1.090±0.050，miR-381組miR-381相對表達量高于mock組和NC組(P均<0.05)。提示轉染成功，可進行下一步實驗。

1.3.2 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將miR-381組、NC組及mock組細胞消化成單細胞懸液后，以2×103個/孔將種植于96孔板上，每孔培養基體積200 μL，分別于培養0、24、48、72、96 h后，每孔加入20 μL的CCK-8溶液，繼續培養1 h，在450 nm波長下用酶標儀測定各孔光密度值(OD值)，以此表示細胞增殖能力。以時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

1.3.3 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。將miR-381組、NC組、mock組細胞接種于6孔板，培養24 h后用胰蛋白酶消化，待細胞長滿培養板后，用200 μL的Tips槍頭沿培養板劃直線，分別于劃痕后即刻和劃痕后48 h計算劃痕面積和劃痕愈合率。劃痕愈合率=(劃痕后即刻劃痕面積-劃痕后48 h劃痕面積)/劃痕后即刻劃痕面積×100%。劃痕愈合率越高，表示細胞遷移能力越強。實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell法。取miR-381組、NC組、mock組2×104個細胞，接種于碳酸磷脂表面，于37 ℃下培養24 h，用1%多聚甲醛與膜下面的細胞結合，哈里斯蘇木精溶液染色，在高倍鏡(200×)下隨機取10個視野，計算穿膜細胞數。實驗重復3次，取平均值。

1.3.5 各組細胞中ID-1 mRNA及蛋白檢測 細胞轉染72 h后提取mRNA及蛋白，采用qRT-PCR法檢測各組細胞中的ID-1 mRNA。采用Western blotting法檢測各組細胞中的ID-1蛋白。將miR-381組、NC組、mock組細胞裂解、變性，每孔30 μg蛋白上樣。濃縮膠條件為50 min、80 V，分離膠條件為100 min、100 V，常規轉膜，加入ID-1及GAPDH一抗，濃度為1∶200，4 ℃孵育過夜，加入二抗37 ℃孵育4 h，PBST漂洗后ECL液顯影。采用Quantity One 1-D軟件分析條帶灰度值。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 腎癌細胞中miR-381表達變化 Caki-2、A498、786-O細胞中miR-381相對表達量分別為0.290±0.030、0.370±0.040、0.51±0.043，HK-2細胞中miR-381相對表達量為1.00±0.04。Caki-2、A498、786-O細胞中miR-381相對表達量低于HK-2細胞(P均<0.01)。

2.2 各組Caki-2細胞增殖能力比較 轉染72、96 h后miR-381組細胞增殖能力低于NC組、mock組(P均<0.05)。詳見表1。

表1 轉染后不同時間三組Caki-2細胞OD值比較

2.3 各組Caki-2細胞遷移、侵襲能力比較 miR-381組、mock組、NC組細胞劃痕愈合率分別為28.7%±2.6%、59.7%±4.8%、56.4%±4.5%，侵襲細胞數分別為(44.7±3.9)、(235.9±17.9)、(225.7±15.7)個，miR-381組細胞劃痕愈合率及侵襲細胞數均少于mock組、NC組(P均<0.01)。詳見圖1A、圖1B。

注：A為細胞劃痕實驗結果；B為Transwell實驗結果。

圖1各組細胞遷移、侵襲能力情況

2.4 各組Caki-2細胞中ID-1 mRNA及蛋白表達比較 miR-381組、mock組、NC組細胞中ID-1 mRNA相對表達量分別為0.38±0.04、1.08±0.09、1.0±0.06，ID-1蛋白相對表達量分別為0.45±0.04、1.11± 0.08、1.0±0.09，miR-381組細胞中ID-1 mRNA及蛋白相對表達量均低于mock組、NC組(P均<0.01)。

3. 討論

腎癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤之一，發病率占泌尿系統腫瘤的第二位[1]。腎癌目前常用的治療方法包括手術和放化療，但療效不理想，因此，尋找合適的早期生物標志物成為研究重點。研究發現多個miRNA異常表達(如miR-34a，miR-141、miR-142-3p、miR-21、miR-155、miR-210)對腎癌細胞發生發展起重要調控作用[10～12]。

miR-381的編碼序列位于14號染色體上，已證實與細胞增殖、分化有關。在腦腫瘤中，miR-381可作為重要的血清診斷標志物及預后標志物。此外，miR-381可以通過抑制C/EBP依賴性的CX43表達而參與乳腺癌的侵襲和轉移過程，通過調控p53/PTTG1通路從而促進垂體腫瘤發生，并可通過抑制SOX4促進胃癌細胞的轉移[8，12]。陳兵海等[7]報道，在腎細胞癌中miR-381呈顯著低表達。本研究選取三個腎細胞癌細胞系，發現相對于人正常腎上皮細胞系HK-2，Caki-2、A498、786-O細胞中miR-381相對表達量降低，與上述研究結果一致。為研究miR-381在腎癌發生發展中的作用，我們上調了Caki-2細胞中miR-381的表達，結果顯示轉染72、96 h后miR-381組細胞增殖能力低于NC組、mock組，miR-381組細胞劃痕愈合率及侵襲細胞數均少于mock組、NC組。這說明miR-381過表達后，Caki-2細胞的增殖、遷移、侵襲能力受到抑制，推測miR-381起到了抑癌基因作用。

研究[13]發現，miR-381可靶向結合ID-1，并確認ID-1為miR-381的靶標分子。ID家族成員的3′非編碼區可能存在一個能夠與miR-381相結合的區域，提示異常高表達的miR-381可能通過對ID的靶向調控從而參與早期癌變過程。ID-1是螺旋-環-螺旋轉錄因子家族成員之一，可通過抑制轉錄因子與DNA的結合，其表達一旦失調，會導致腫瘤的發生[14]。ID-1主要功能是促進細胞增殖，并抑制細胞分化，誘導血管形成，與腫瘤進展及預后相關[15]。目前研究認為，ID-1主要是通過調控細胞周期來影響細胞增殖、分化的。在正常組織中，ID-1蛋白表達水平較低甚至不表達；而在惡性腫瘤中，如前列腺癌、膀胱癌、食道癌等組織中均可檢測到ID-1高表達[16～18]。故有學者[18～20]認為ID-1是腫瘤診斷及預后標志物。為探討miR-381參與腎癌細胞增殖、遷移、侵襲的機制，我們進一步檢測了三組細胞中的ID-1 mRNA及蛋白，結果顯示，miR-381組細胞中ID-1 mRNA及蛋白相對表達量均低于mock組、NC組，提示miR-381能夠通過作用于ID-1來發揮抑癌作用，抑制腎癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力。

綜上所述，腎癌細胞中miR-381呈低表達；過表達miR-381可降低腎癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力，其機制可能與ID-1表達下調有關。miR-381參與了腎癌細胞的增殖調控，可能成為腎癌新的治療靶點。然而，本研究是在體外細胞系中進行的實驗研究，至于在動物實驗中結果如何以及miR-381在體內組織中的表達與腫瘤預后的關系，都需要進一步研究。

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