超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜篩查水產(chǎn)品中62種藥物殘留

張　樂，劉　超，翁麗萍

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州　310024)

目前，隨著人們生活水平的提高，對(duì)各類水產(chǎn)品的消費(fèi)量日益增大，但水產(chǎn)養(yǎng)殖及運(yùn)輸?shù)冗^程中違規(guī)用藥的事情層出不窮，且使用的藥物種類繁多，這些獸藥的濫用亂用給消費(fèi)者健康帶來了極大地隱患。目前已報(bào)道的水產(chǎn)品中藥物殘留主要有磺胺類[1-4]、喹諾酮類[5-10]、四環(huán)素類[11-14]、硝基咪唑類[15]、大環(huán)內(nèi)酯類[16-17]等抗生素，以及激素類[18-21]等藥物。

目前水產(chǎn)品中抗生素及激素類藥物殘留監(jiān)測(cè)主要有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫及膠體金法等，但抗生素類及激素類藥物種類繁多，僅抗生素臨床使用的就近千種，若想篩查出影響質(zhì)量安全的具體藥物，需要投入巨大的人力物力進(jìn)行一系列檢測(cè)試驗(yàn)，成本巨大且周期很長(zhǎng)。

高分辨篩查技術(shù)可提供質(zhì)量范圍內(nèi)目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù)，具有選擇性高、受干擾小、掃描速度快等特點(diǎn)，而在藥物篩查方面受到越來越多的關(guān)注。張曉光等[22]利用超高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速篩查保健品中23種非法添加西藥成分。嚴(yán)鳳等[23]利用超高效液相色譜一四級(jí)桿一靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜篩查測(cè)定飼料中19種磺胺類藥物，但利用靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜高通量篩查水產(chǎn)品藥物殘留國內(nèi)未見報(bào)道。

本研究通過建立Q-E質(zhì)譜篩查信息庫，并建立超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜篩查水產(chǎn)品中62種藥物殘留的方法，達(dá)到快速準(zhǔn)確篩查的目的。

1　材料與方法

1.1　儀器和試劑

儀器有Q-Exactive超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(美國ThermoFisher公司)，MS204電子天平(瑞士梅特勒公司)，Eppendorf5810R離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，氮吹儀(OrganomationN- EVAP-24)，Hei-VAPPrecision全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國，海道爾夫)。

標(biāo)準(zhǔn)品：萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、西諾沙星、吡哌酸、諾氟沙星、依諾沙星、環(huán)丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、丹諾沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、麻保沙星、氟羅沙星、加替沙星、沙拉沙星、司帕沙星、雙氟沙星、磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲基異惡唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺氯噠嗪、甲氧芐啶磺胺喹惡啉、磺胺多辛、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺苯吡啶、土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素、美他環(huán)素、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫、甲硝唑、二甲硝咪唑、替硝唑、奧硝唑、克林霉素、克拉霉素、阿奇霉素、紅霉素、羅紅霉素、甲基睪酮、炔諾酮、醋酸氯地孕酮、左炔諾孕酮、利福平、氨芐西林、頭孢拉定(德國Dr．Ehrenstofer公司)。

甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨(色譜純，美國Fisher公司)。

1.2　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg，甲醇溶解并定容至25 mL，得到濃度為500 μg·mL-1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18 ℃冷凍保存。使用時(shí)用30%乙腈溶液稀釋至所需濃度的單標(biāo)或混標(biāo)。

1.3　樣品前處理

5 g樣品，加入10 mL 0.1%甲酸乙腈，超聲5 min，渦旋1 min，4 000 r·min-1離心10 min，取出上清液，殘?jiān)儆?0 mL0.1%甲酸乙腈提取1次，合并提取液35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干，2 mL溶解液溶解，過0.2 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.4　儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱：AcquityUPLCBEHC18，2.1 mm×150 mm，1.7 μm。流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸+2 mmol甲酸銨；梯度洗脫，洗脫程序：0～2 min，5%A；2～8 min，5%～30%A；8～15 min，30%～95%A；15～17 min，95%A；17～20 min，5%A；流速0.3 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件

正離子掃描，分辨率70 000，毛細(xì)管電壓3.2 KV，離子傳輸管溫度320 ℃，氣化溫度350 ℃，鞘氣壓40 arb，輔助氣壓10 arb，一級(jí)質(zhì)譜駐留時(shí)間100 ms，二級(jí)質(zhì)譜駐留時(shí)間50 ms，一級(jí)全掃描范圍m/z60～850，掃描模式Funscan+ddms(一級(jí)全掃描+自動(dòng)觸發(fā)二級(jí)質(zhì)譜掃描)，碰撞能量為(40±60)% eV。

2　結(jié)果與分析

2.1　篩查數(shù)據(jù)庫的建立

取合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述質(zhì)譜條件下進(jìn)行掃描，得到目標(biāo)物的準(zhǔn)確荷質(zhì)比，然后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到目標(biāo)物的二級(jí)質(zhì)譜掃描圖和離子碎片信息，最后在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)樣，得到目標(biāo)物的保留時(shí)間信息，根據(jù)上述信息建立62種藥物的篩查信息數(shù)據(jù)庫(表1)。

對(duì)比一級(jí)母離子的理論和實(shí)測(cè)結(jié)果的m/z，偏差范圍在0.02～1.74×10-6，符合高分辨質(zhì)譜定性的質(zhì)量準(zhǔn)確度誤差5×10-6以內(nèi)的要求。

2.2　樣品提取與色譜條件的選擇

樣品提取液測(cè)試了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸甲醇等幾種，通過添加回收比對(duì)，選取0.1%甲酸乙腈作為提取劑。

在色譜條件方面，測(cè)試了不同色譜柱(HypersilGold C182.1 mm×100 mm，1.7 μm；ACQUITYUPLCHSST 32.1 mm×100 mm，1.7 μm；ACQUITYUPLCBEHC18 2.1 mm×150 mm，1.7 μm)、不同流動(dòng)相(乙腈-0.1%甲酸體系；乙腈-0.1%甲酸+2 mmol·L-1甲酸銨體系)及不同流動(dòng)相梯度的情況。T3柱分離喹諾酮類藥物峰形拖尾，其他幾種條件對(duì)大部分物質(zhì)分離良好，但幾組同分異構(gòu)體分不開，最后通過測(cè)試選擇1.4.1的條件。上述條件下，目標(biāo)物響應(yīng)良好(圖1)，各組同分異構(gòu)體分離度和峰形均達(dá)到較滿意的結(jié)果，見m/z=311.1同分異構(gòu)體磺胺多辛和磺胺間二甲氧嘧啶(圖2),m/z=281.1同分異構(gòu)體磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺6-甲氧嘧啶和磺胺甲氧噠嗪(圖3)，m/z=445.2同分異構(gòu)體四環(huán)素和強(qiáng)力霉素(圖4)。

圖1　全掃描的結(jié)果

圖2　m/z=311.1同分異構(gòu)體的色譜

表1　藥物篩查的信息

圖3　m/z=281.1同分異構(gòu)體的色譜

圖4　m/z=445.2同分異構(gòu)體的色譜

2.3　檢出限與回收率

根據(jù)檢測(cè)限信噪比>3，定量限信噪比>10的要求，確定本方法的檢出限10 μg·kg-1。在淡水魚、甲魚兩種基質(zhì)中分別添加20、200 μg·kg-1濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，回收率范圍在48.3%～105.8%。部分藥物回收率偏低，可能因?yàn)榛|(zhì)效應(yīng)，以及前處理方式還有改進(jìn)空間，但本研究作為一個(gè)高通量的快速篩查方法，主要是定性的準(zhǔn)確性，定量可通過后續(xù)三重四極桿液質(zhì)進(jìn)一步驗(yàn)證確認(rèn)。

2.4　實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究建立的方法檢測(cè)篩查了12批次水產(chǎn)樣品，其中一批次淡水魚樣品篩查出恩諾沙星，結(jié)果與三重四級(jí)桿液質(zhì)檢測(cè)結(jié)果接近。

3　小結(jié)

本研究建立了超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜篩查水產(chǎn)品中藥物殘留的方法，在20 min的內(nèi)完成62種藥物的篩查確證。方法具有質(zhì)量精度高、前處理簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，達(dá)到快速高通量準(zhǔn)確篩查水產(chǎn)品藥物殘留的目的。

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