T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)及結(jié)核蛋白芯片試驗(yàn)對(duì)淋巴結(jié)核的診斷價(jià)值

結(jié)核病為結(jié)核分歧桿菌引發(fā)的傳染病，幾乎可累及人體所有器官和組織，淋巴結(jié)核約占肺外結(jié)核發(fā)病率的30%[1]。由于淋巴結(jié)核發(fā)病較為隱匿，其臨床癥狀表現(xiàn)也并不明顯，臨床上易造成誤診及漏診，對(duì)患者預(yù)后造成影響。因而臨床迫切需要一種快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)手段，從而為淋巴結(jié)核患者制定正確的治療方案。結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)與T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(T cells enzyme linked immunospot,T-SPOT.TB)做為診斷結(jié)核病的有效方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，對(duì)于肺結(jié)核病的診斷，這兩種方法具有特異性較強(qiáng)、檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn)，但在肺外結(jié)核尤其是淋巴結(jié)核診斷中目前應(yīng)用較少[2]。本文對(duì)結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)、T-SPOT.TB試驗(yàn)在淋巴結(jié)核及非結(jié)核感染患者診斷中的應(yīng)用進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取安徽省胸科醫(yī)院2014年1月至2017年5月收治的患者為研究對(duì)象，簡(jiǎn)單隨機(jī)抽取淋巴結(jié)核患者30例為研究組，同時(shí)抽取確診為非結(jié)核感染的患者30例為對(duì)照組，淋巴結(jié)核診斷以病原學(xué)或病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)。研究組：男性8例，女性22例 ，年齡14～75歲，平均(40.96±14.16)歲；對(duì)照組：男性11例，女性19例,年齡20～73歲，平均(36.76±12.38)歲。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

入選標(biāo)準(zhǔn)：淋巴結(jié)腫大入院，通過(guò)病原學(xué)或病理學(xué)活檢確診為淋巴結(jié)核的患者；對(duì)照組經(jīng)過(guò)影像學(xué)檢查、痰菌檢查、病原學(xué)或病理學(xué)活檢確診不患有結(jié)核病。排除標(biāo)準(zhǔn)：HIV陽(yáng)性患者；入院前四周接受過(guò)抗結(jié)核治療的患者；患者在入院前及住院期間接受免疫抑制劑治療；患有其他對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響疾病的患者。

1.2研究方法

1.2.1蛋白芯片法南京大淵生物技術(shù)工程有限公司提供芯片和試劑，南京大淵生物技術(shù)工程有限公司生產(chǎn)PBT-X2型生物識(shí)別儀對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行分析，操作步驟按說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。采集患者靜脈血，樣品編號(hào)在蛋白芯片上標(biāo)記，將患者血清100 μL滴加入蛋白芯片盒內(nèi)窗口，按操作步驟順序滴加反應(yīng)試劑，在試劑反應(yīng)結(jié)束后半小時(shí)內(nèi)采用PBT-X2型生物識(shí)別儀對(duì)芯片進(jìn)行結(jié)果分析，PBT-X2型生物識(shí)別儀設(shè)置參數(shù)對(duì)陰性和陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行判別。判別標(biāo)準(zhǔn)：脂阿拉伯甘露聚糖，兩種分子量不同的結(jié)核分枝桿菌蛋白任一抗體檢測(cè)陽(yáng)性即判別結(jié)果為陽(yáng)性。

1.2.2T-SPOT.TB試驗(yàn)英國(guó)Oxfordimmunotec 提供T-SPOT.TB檢測(cè)試劑盒，操作步驟按說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。采集患者靜脈血，分離PBMCs，加培養(yǎng)液重懸PBMCs并孵育過(guò)夜，配制每100 μL含有25萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)溶液500 μL，每患者個(gè)樣本設(shè)置4個(gè)檢測(cè)孔：空白對(duì)照孔(細(xì)胞培養(yǎng)液)、抗原A檢測(cè)孔、抗原B檢測(cè)孔、陽(yáng)性對(duì)照孔(植物血凝素)。每孔加入100 μL細(xì)胞終溶液，在37℃保持濕潤(rùn)的含有5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育16～20 h，洗板，然后在每個(gè)反應(yīng)孔加入50 μL標(biāo)記抗體工作液，2～8℃孵育1 h，洗板后每個(gè)反應(yīng)孔加入50 μL底物顯色溶液室溫孵育7min，離子水徹底洗滌培養(yǎng)板終止反應(yīng)，通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)系統(tǒng)采用專(zhuān)門(mén)的ELISPOT讀板儀斑點(diǎn)數(shù)量。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)時(shí)且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))減去(空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6；空白對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)時(shí)且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))。

2　結(jié)果

2.1兩組試驗(yàn)結(jié)果比較研究組結(jié)核蛋白芯片試驗(yàn)陽(yáng)性率為60.00%，T-SPOT.TB試驗(yàn)陽(yáng)性率為90.00%，均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1兩組患者試驗(yàn)結(jié)果比較[例(%)]

試驗(yàn)研究組(n=30)對(duì)照組(n=30)陽(yáng)性陰性陽(yáng)性陰性χ2值P值結(jié)合蛋白芯片18(60．00)12(40．00)6(20．00)24(80．00)10．0000．003T-SPOT．TB27(90．00)3(10．00)2(6．67)28(93．33)41．7100．000

2.2聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果比較研究組聯(lián)合檢測(cè)雙陽(yáng)性率為53.33%，高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對(duì)照組聯(lián)合檢測(cè)雙陰性率為73.33%,高于研究組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2兩組患者聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果比較[例(%)]

結(jié)果研究組(n=30)對(duì)照組(n=30)χ2值P值雙陽(yáng)性16(53．33)2(6．67)13．4130．000雙陰性2(6．67)22(73．33)25．0690．000

2.3特異度、敏感度比較T-SPOT.TB試驗(yàn)敏感度為90.90%，結(jié)核蛋白芯片試驗(yàn)敏感度為71.42%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.383，P=0.036)。T-SPOT.TB試驗(yàn)特異度為93.75%，結(jié)核蛋白芯片試驗(yàn)特異度為83.33%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.910，P=0.340)。

3　討論

結(jié)核病目前已成為我國(guó)關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題[3]。淋巴結(jié)核系結(jié)核桿菌感染人體淋巴系統(tǒng)產(chǎn)生的結(jié)核病變，包括體表和深部淋巴結(jié)核，淋巴結(jié)核常見(jiàn)類(lèi)型有頸部淋巴結(jié)核、縱隔淋巴結(jié)結(jié)核、腹內(nèi)淋巴結(jié)核等[4]。目前對(duì)于淋巴結(jié)核尚缺乏有效的診斷手段，對(duì)此類(lèi)疾病的漏診率、誤診率較高。淋巴結(jié)核的診斷多需行手術(shù)活檢淋巴組織，結(jié)合病原學(xué)或者病理學(xué)才能明確診斷[5]。

目前，臨床檢測(cè)患者血清中是否存在結(jié)核分枝桿菌可采用結(jié)核蛋白芯片、T-SPOT.TB 試驗(yàn)等方法[6]。結(jié)核蛋白芯片克服了結(jié)核分枝桿菌感染人體后，免疫背景及病程造成的抗原表達(dá)數(shù)量、種類(lèi)不同導(dǎo)致的檢測(cè)特異性降低[7]。人體受結(jié)核分枝桿菌感染后T細(xì)胞受刺激而活化，T-SPOT.TB做為一種體外診斷能夠檢測(cè)活化的效應(yīng)T細(xì)胞，從而診斷結(jié)核感染[8]。T-SPOT.TB對(duì)具有結(jié)核潛伏感染風(fēng)險(xiǎn)或疑似結(jié)核病的患者均適用，同時(shí)該方法能夠減少其他分枝桿菌、卡介苗接種引起的假陽(yáng)性結(jié)果[9]。本研究結(jié)果表明，T-SPOT.TB試驗(yàn)敏感度較高，特異度較強(qiáng)。

針對(duì)淋巴結(jié)核目前尚缺乏簡(jiǎn)便、靈敏的診斷方法，結(jié)核蛋白芯片雖然可以輔助診斷結(jié)核，但其對(duì)淋巴結(jié)核陽(yáng)性率較低[10]。T-SPOT.TB檢測(cè)方法已成為臨床診斷結(jié)核病較為敏感的檢測(cè)方法[11]。本研究發(fā)現(xiàn)2例假陰性患者，可能與患者受結(jié)核感染階段不同，靜脈血液采集在患者細(xì)胞免疫發(fā)生之前，患者存在腫瘤、免疫功能低下、口服免疫抑制劑等問(wèn)題相關(guān)[12]。T-SPOT.TB結(jié)果僅提示患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的特異效應(yīng)T細(xì)胞，不能確定其結(jié)核是否處于活動(dòng)期。如果將結(jié)核蛋白芯片檢測(cè)與T-SPOT.TB聯(lián)合檢測(cè)，相互印證可能更有利于淋巴于結(jié)核的診斷。本研究顯示研究組聯(lián)合檢測(cè)雙陽(yáng)性率高于對(duì)照組，對(duì)照組聯(lián)合檢測(cè)雙陰性率高于研究組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，T-SPOT.TB敏感度高于結(jié)核蛋白芯片試驗(yàn)敏感度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)核蛋白芯片聯(lián)合T-SPOT.TB檢測(cè)可以輔助診斷淋巴結(jié)核。

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