豚鼠近視模型中屈光度眼軸長度及鞏膜Ⅰ型膠原纖維變化的研究

在全球屈光性疾病中，近視的發病率居首，且常見于學齡兒童及青少年。在亞洲及東南亞地區的城市中，青少年受近視的困擾最甚。這不僅給青少年帶來苦惱，也增加了全球負擔[1-2]。我國近視發病率已位居世界第二，僅次于日本，占世界近視總人數的33%[3-4]，但目前近視的發病機制仍不是十分清楚。因此，對近視發病機制的研究是亟待解決的醫學難題。

以往的研究[5]認為，新生動物或人眼正視化進程有賴于眼的各部分相互協調和精確調控，早期適宜的視覺經驗對眼球的正常生長與正視化進程非常重要。在動物發育早期，如剝奪其形覺視覺以干擾正視化視覺依賴性反饋機制，將導致眼軸過度延長，產生近視，即形覺剝奪性近視[6]。研究[7]顯示，鞏膜重塑在近視的發生發展進程中起到至關重要的作用。鞏膜中含量最多的是膠原纖維，占鞏膜凈重的90%，Ⅰ型膠原纖維在鞏膜中占75%以上[8]。早期研究[9]表明，形覺剝奪性近視可導致玻璃體腔擴大，鞏膜組織結構也發生變化,特別是后極部。本研究通過面罩遮蓋豚鼠單眼制作形覺剝奪性近視(form deprivation myopia，FDM)模型，對實驗組和兩組對照組進行屈光度和眼軸長度的測量，并觀察后極部鞏膜中Ⅰ型膠原纖維的變化，現報道如下。

1　材料與方法

1.1倫理學聲明實驗程序依照《實驗動物管理與使用指南》[10]。本研究方案經安徽醫科大學實驗動物倫理委員會審查批準(LLSC20150115)。

1.2動物形覺剝奪模型的建立和分組選用出生7 d，體質量為100～140 g的健康新生有色豚鼠75只，采用帶狀光檢影法排除有先天性近視及其他全身疾病的豚鼠，在安徽醫科大學附屬省立醫院實驗動物中心室內12 h自然照明和12 h黑暗環境下(以每天上午8時為起始時間)，并給予水、富含維生素的豚鼠飼料及新鮮蔬菜等飼養，室內溫度為22℃。將75只豚鼠采用完全隨機分組方法分為空白對照組(共25只，分為5組，每組5只)和FDM模型組(50只，分為5組，每組10只)。豚鼠(誘導前、誘導后2、4、6周及誘導4周去誘導1周)FDM組佩戴頭套，具體方法：采用6號半透明乳膠氣球套住豚鼠頭部，將對照眼、鼻唇部及耳部氣球剪去并暴露，左眼氣球保留遮蓋，用訂書機將氣球頭套于頸部對折固定，防止眼罩滑落及旋轉。遮蓋眼為形覺剝奪組，對側未遮蓋眼為自身對照組，空白對照組不做任何處理。

1.3觀察指標及方法

1.3.1屈光度及眼軸長度將豚鼠標記、編號，分別于誘導前0 周、誘導后2周、4周、6周及誘導4周去誘導1周(4/-1周)，托吡卡胺充分擴瞳，在暗室內采用帶狀光檢影(六六,中國)驗光，取其平均值，并精確到0.01 D；結膜囊滴用0.5%鹽酸丙美卡因表面麻醉藥物后，A超(TOMEY AL-100，日本)測定雙眼眼軸長度(取角膜頂點到眼球后極部玻璃體視網膜界面的距離)，以手動模式連續測量3次，取其平均值，精確到0.01 mm，由2名熟練的技師采用雙盲法分別測量。

1.3.2后極部鞏膜Ⅰ型膠原的免疫組化檢測所有豚鼠均使用過量的1%戊巴比妥鈉處死，摘除眼球放在提前備好的冰塊上，去除眼前節。在以視神經為中心，直徑為6 mm的范圍內，切除鞏膜組織，并剔除視神經部分。然后將鞏膜組織放入40%二聚甲醛溶液中，4℃保存。組織脫水, 石蠟包埋、切片作HE染色及免疫組化染色。一抗：Ⅰ型膠原，稀釋度1∶150。陰性對照以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)替代一抗,其余步驟相同。結果判定：Ⅰ型膠原在胞質中表達，呈棕黃色。隨機選取后極部鞏膜各10個部位進行圖像掃描，遵循雙盲原則測量Ⅰ型膠原的相對蛋白表達量。

2　結果

2.1眼球屈光度出生后1周左右，豚鼠雙眼呈遠視狀態，3組中豚鼠的屈光度兩兩相比，差異無統計學意義。隨著遮蓋時間的不斷延長，FDM組的屈光狀態逐漸由遠視變成近視。空白對照組和自身對照組遠視度數略有減低，兩組間在每個時間點的差異均無統計學意義。除實驗前，FDM組眼屈光狀態和空白對照組及自身對照組各時間點的差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1、2 。

表1　FDM組與空白對照組在造模前后不同時間點屈光度比較±s，D)

注：F分組是FDM組與空白對照組間總體的比較；F時間是不同時間點與各自時間點空白對照組總體比較，與各自時間點空白對照組比較，aP<0.05(兩因素方差分析，LSD-t檢驗)

表2　自身對照組與FDM組不同時間點屈光度值比較±s，D)

2.2眼軸長度遮蓋前，空白對照組、自身對照組及FDM組的豚鼠眼球的眼軸長度兩兩相比，差異無統計學意義(P>0.05)。隨著遮蓋時間的不斷延長，FDM組的眼軸長度逐漸延長。空白組對照組和自身對照組眼軸長度略有延長，各時間點兩組間的差異均無統計學意義(P>0.05)。FDM組眼屈光狀態和自身對照組及空白對照組比較，除遮蓋前，其余時間點的差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3、4。

表3　空白對照組與FDM組不同時間點眼軸長度比較±s，mm)

注：F分組是FDM組與空白對照組間總體的比較；F時間是不同時間點與各自時間點空白對照組總體比較，與各自時間點空白對照組比較，bP<0.05(兩因素方差分析，LSD-t檢驗)

表4　自身對照組與FDM組不同時間點眼軸長度比較±s，mm)

注：FDM為形覺剝奪性近視

2.3FDM組屈光度與眼軸長度之間的相關性分析FDM組中，豚鼠眼球的屈光度發生了明顯的變化，隨著遮蓋時間的不斷延長，由遮蓋前的遠視眼逐漸演變為近視眼，且屈度數不斷增加，同時，眼軸長度也不斷增長，兩者之間存在顯著的負相關(r=-0.997，P<0.05)。

2.4鞏膜中Ⅰ型膠原纖維的變化在遮蓋前0周時，FDM組與兩組對照組的Ⅰ型膠原纖維無明顯差別；FDM組遮蓋2周、4周、4/-1周及6周的亞組中，Ⅰ型膠原纖維隨著遮蓋時間的延長，表達量逐漸下降；而空白對照組及自身對照組的Ⅰ型膠原纖維卻無明顯變化。見表5、6，圖1。

表5　空白對照組與FDM組Ⅰ型膠原蛋白的相對表達量比較±s，ug/L)

注：F分組是FDM組與空白對照組間總體的比較；F時間是不同時間點與各自時間點空白對照組總體比較，與各自時間點空白對照組比較，cP<0.05(兩因素方差分析，LSD-t檢驗)；FDM為形覺剝奪性近視

表6　自身對照組與FDM組不同時間點Ⅰ型膠原蛋白相對表達量比較±s，ug/L)

注：FDM為形覺剝奪性近視

圖1　豚鼠后極部鞏膜型膠原纖維的變化(×400)

注：A為FDM組未遮蓋；B為FDM組遮蓋2周；C為FDM組遮蓋4周；D為FDM組遮蓋4周去遮蓋1周；E為FDM組遮蓋6周；F為空白對照組未遮蓋；G為空白對照組遮蓋2周；H為空白對照組遮蓋4周；I為空白對照組遮蓋4周去遮蓋1周；J為空白對照組遮蓋6周；K為自身對照組未遮蓋；L為自身對照組遮蓋2周；M為自身對照組遮蓋4周；N為自身對照組遮蓋4周去遮蓋1周；O為自身對照組遮蓋6周

3　討論

本實驗是在利用半透明面罩來遮蓋豚鼠，從而使視網膜模糊成像，結果顯示，豚鼠形覺剝奪性近視的形成過程中伴隨著眼球近視度數逐漸增加和眼軸長度不斷增長，表明成功構建了形覺剝奪性近視動物模型。本實驗采用12 h/12 h晝夜交替遮蓋，從而避免在黑暗條件下無法順利形成近視。研究結果與楊蓓等[11]的研究相符合，他們也是利用相似手段，從而構建豚鼠近視模型，觀察短期豚鼠形覺剝奪性近視的屈光狀態、眼軸及后極部鞏膜的改變。實驗顯示，隨著時間的延長，實驗組豚鼠逐漸變為近視，同時，眼軸長度也不斷延長。在實驗前(0周)時，FDM組與空白對照組及自身對照組的屈光度及眼軸長度無明顯區別，差異無統計學意義,隨著遮蓋時間的延長，FDM組與兩組對照組間以后每個時間點所測屈光度及眼軸長度差異均有統計學意義(P<0.05)，但空白對照組與自身對照組在每個時間點的屈光度及眼軸長度差異均無統計學意義。FDM組除遮蓋4周去遮蓋1周與遮蓋4周兩亞組間的屈光度及眼軸長度差異無統計學意義,其余各亞組間的差異均有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，形覺剝奪法可成功構建近視動物模型，另外，從遮蓋4周去遮蓋1周的豚鼠亞組的實驗結果可知，一旦形覺剝奪的誘導去除，豚鼠的近視進展便會基本停止。FDM組各個亞組的屈光度及眼軸長度間呈高度的負相關，說明在一定程度內，隨著近視度數進展，眼軸長度逐漸延長[10]。

Rada等[12]認為，大多數近視是通過延長眼球的玻璃體腔產生的。高度近視的特征在于鞏膜變薄和后鞏膜的局部擴張。鞏膜作為眼睛的外涂層十分致密，由纖維狀的粘彈性結締組織及不規則排列的膠原纖維薄片組成，其間填充蛋白聚糖和非膠原糖蛋白。鞏膜成纖維細胞位于鞏膜片層之間，并且負責合成它們所在的細胞外基質。鞏膜細胞外基質重塑是近視發生發展的重要環節。在實驗的兩組對照組的后極部鞏膜中可以觀察到，Ⅰ型膠原纖維無明顯變化，但在FDM組各亞組豚鼠的后極部鞏膜中，Ⅰ型膠原纖維的表達量在不斷降低，這與Harper等[13]的研究相符合。從而可以進一步說明，在豚鼠出生早期進行形覺剝奪，可以很快使鞏膜出現病理改變，且這種改變會隨著遮蓋時間的延長表現的越來越明顯。Jonas等[14]的研究認為，在近視進展中，形態學的改變先于生物學, 在近視早期，鞏膜通過代償調節，當調節失代償后，才會出現生物學改變。本實驗的結果并未完全支持這種結論，這可能是本研究分組的時間點設置較長導致。

綜上所述，使用形覺剝奪法順利成功構造了近視動物模型，對于出生不久的豚鼠，在遮蓋不久后便出現屈光度及眼軸長度的變化，在一定程度內，隨著遮蓋時間的不斷延長，這種變化會越來越明顯，且兩者的變化呈高度的負相關性。本研究只是對動物近視模型中屈光度、眼軸長度及鞏膜Ⅰ型膠原纖維變化進行初步研究，對于其確切機制還有待進一步的深入研究。

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