CTGF對犬眼小梁切除術后濾過泡瘢痕化和眼壓的影響

張東彥 ， 鄭之琬 ， 欒司琦 ， 鄭小波

(西南大學動物科學學院 ， 重慶 榮昌 402460)

小梁切除術能夠有效降低眼壓，是人醫上各類型青光眼最常用的手術方式。而該術式已有學者移植到犬的青光眼治療當中。但濾過通道瘢痕化常導致眼壓再次升高，使得手術失敗。因此，如何抑制、減少濾過泡瘢痕化和保證濾過通道的通暢是手術成功的關鍵。

CTGF是一類致纖維化生長因子，廣泛存在于多種動物組織器官中，多種細胞可表達CTGF[1]。但在病理狀態下，CTGF的過表達與某些纖維化性和增生性疾病的發生、發展密切相關，并且在機體組織的損傷修復過程中起決定性作用。目前，CTGF在人醫的眼科研究中尚處于起步階段，有關其在濾過泡組織瘢痕化過程中的表達及作用，在國內外鮮有報道，動物眼科研究上更是空白。因此本試驗通過對犬結膜瘢痕化模型的建立，以免疫組織化學方法從蛋白水平觀察CTGF在結膜下濾過泡組織中的表達，以及通過外源性CTGF注入濾過泡中觀察其對濾過泡瘢痕形成和眼壓的作用，初步探討CTGF對濾過泡組織瘢痕化和眼壓的影響，為提高犬青光眼小梁切除術的成功率提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗動物雜交犬32只，3月齡，公母各半。購自重慶市榮昌區肉犬養殖基地。

CTGF液的配置：購入重組CTGF 20 μg，-20 ℃保存。取0.41 g NaAc溶解到1 L蒸餾水中，取0.2 mL NaAc溶液溶解20 μg CTGF，加入1 mL PBS形成1.2 mL CTGF液。

1.2 試驗方法

1.2.1 手術方法及免疫組織化學染色切片 手術參照史亞利手術方法[2]。于術前及術后第3、5、7、14、21、28 天取出眼球置于4%甲醛中4 ℃固定24 h，剪取濾過泡區域的結膜、結膜下組織及鞏膜的塊狀組織(5×5 mm),流水沖洗8 h，經梯度酒精脫水后，行浸蠟、包埋、切片。試驗組與對照組各時間點隨機選取3張供CTGF免疫組織化學染色觀察和分析。

1.2.2 免疫組化染色觀察結果的判斷 定性觀察：CTFG蛋白免疫組織化學染色結果的判定標準[8]：光鏡下觀察，細胞漿呈黃色或深棕色為CTGF染色陽性。以PBS代替第一抗體作為陰性對照。CTGF相關抗原以胞膜或胞漿出現棕黃色顆粒為陽性反應。陰性對照組除細胞核染成藍色外胞核和胞漿內無棕黃色反應物。

定量分析：采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統對CTGF的表達進行定量分析。每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野，測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率(陽性反應總面積所占分析視野面積的百分比)，用以表示陽性物質的相對含量。

1.2.3 外源性CTGF注入 將已經進行小梁切除術的犬16只隨機分為試驗組和對照組，試驗組犬術眼結膜瓣下分別注入0.2 mL CTGF液，對照組犬術眼結膜瓣下分別注入0.2 mL生理鹽水。術后每天對術眼涂抹地塞米松軟膏3次，連續使用1周。

1.2.4 術后濾過泡的觀察 小梁切除術后每天分別對每只術犬術眼用裂隙燈嚴格進行觀察，參照Khaw方法觀察濾過泡顏色和隆起度、形態，將濾過泡充血微隆起或消失，結膜下瘢痕化粘連在鞏膜表面，局限原頂狀隆起多血管外觀，呈囊樣增生為致密的球結膜空腔定義為濾過泡失敗，記錄濾過泡失敗時間，以此評價術后濾過泡的生存情況。

1.2.5 眼壓的測定 術前以及術后1、3、5、7、14、21 d對術眼進行眼壓的測定并記錄。

2 統計分析

3 試驗結果

3.1 免疫組織化學染色觀察 對照組免疫組化染色情況：染色陽性信號為棕黃色顆粒。染色各時間點只見少量棕黃色顆粒，著色淡，CTGF染色幾乎無陽性信號(見中插彩版圖1)。

陰性對照組免疫組化染色情況：陰性對照組除細胞核染成藍色外，胞漿內無棕黃色反應物(見中插彩版圖2)。

3.2 試驗組免疫組化染色情況 術后第3天：CTGF染色可見顆粒狀和彌散性分布的棕黃色顆粒，開始出現陽性信號，主要分布于結膜上皮細胞、鞏膜、脈絡膜結締組織中的成纖維細胞胞漿中(見中插彩版圖3)。

術后第5天：CTGF染色可見棕黃色顆粒比上組增多，陽性信號較上組增強(見中插彩版圖4)。

術后第7天：CTGF染色可見棕黃色顆粒在整個試驗組達到最多。陽性信號增強達高峰，染色密度無明顯差別(見中插彩版圖5)。

術后第14天：CTGF染色可見棕黃色顆粒開始漸減，陽性信號開始減弱(見中插彩版圖6)。

術后第21天：CTGF染色可見棕黃色顆粒較14 d 減少，陽性信號持續減弱(見中插彩版圖7)。

術后第28天：CTGF染色陽性棕黃色顆粒大量減少，陽性信號明顯減弱，陽性信號略強于空白對照組。染色可見極少量棕黃色顆粒(見中插彩版圖8)。

3.3 CTGF蛋白定量分析結果 試驗組中CTGF蛋白陽性顆粒面的陽性面積率隨手術后時間變化呈先升高后下降的變化，在第7天達到峰值(圖9)。對照組中CTGF蛋白陽性顆粒幾乎觀察不到。手術后第7天試驗組與對照組差別具有極顯著性意義(P<0.01)，手術后第3、7天，差別具有顯著性意義(P<0.05)。對照組各時間點密度值的差別無統計學意義(P>0.05)。

圖9 手術前后CTGF蛋白質顆粒的陽性

3.4OD值分析結果 試驗組中OD值隨手術后時間變化呈先升高后下降的變化，在第7 天達峰值(圖10)。對照組中OD值變化不大(圖10)。手術后第7天試驗組與對照組OD值差別具有極顯著性意義(P<0.01)，手術后第3、 7天，差別具有顯著性意義(P<0.05)。對照組各時間點密度值的差別無統計學意義(P>0.05)。

圖10 手術前后OD值比較

3.5 術后眼壓的變化 術前和術后第1、3、5、7、14、21天眼壓的測定結果(表1)，術后試驗組和對照組各時間點的眼壓測定值差異都具有統計學意義差異極顯著(P<0.01)。

3.6 術后濾過泡的變化 試驗組和對照組犬小梁切除術術后濾過泡失敗時間如表2所示。試驗組平均濾過泡失敗時間為13.16±0.98 d，對照組平均濾過泡失敗時間為20.05±1.05 d。差別有統計學意義(P<0.01)。

表1 術前及術后各時間點眼壓測定值

表2 術犬濾過泡失敗時間

4 分析討論

CTGF最早是Bradham等[3]用親和色譜法在人臍靜脈內皮細胞條件培養基中發現的，廣泛存在于多種人類組織器官中，如心、腦、肺、腎、胎盤、胰腺和結締組織。多種細胞都可表達CTGF。正常情況下體內的CTGF表達很低或者無，但在病理狀態下CTGF可過度表達并與某些增生性或纖維化性疾病的發生、發展密切相關。CTGF的生物學作用及作用機制尚未明確，目前認為CTGF有調控細胞分裂、粘附和遷移、誘導ECM產生等功能，從而在調控細胞增殖、分化、胚胎發育、血管生成、傷口愈合、腫瘤生長、炎癥、纖維化疾病等方面有重要作用[4-5]。試驗切片染色觀察中，CTGF主要在濾過泡組織成纖維細胞中異常表達，而周圍的正常組織中，CTGF的表達相對較少。Tang等[6]的研究發現，兔抗青光眼濾過手術術后結膜濾過泡組織中存在CTGF的高表達，并且在術后第5天達最高值與我們的試驗結果基本一致。而Igarashi等[7]通過原位雜交的方法發現，增生性瘢痕組織中成纖維細胞存在CTGF mRNA強陽性表達信號，從基因水平證實了組織纖維化進程中CTGF表達的增高。由此可以推測，在濾過泡瘢痕化過程中，CTGF先進行轉錄，進而翻譯成CTGF蛋白質，CTGF蛋白質可能刺激組織中成纖維細胞的增殖和以膠原為主的細胞外基質的沉積，增殖的成纖維細胞又會產生更多的CTGF，反復循環，最終形成大量的纖維化癱痕組織。CTGF僅是在濾過泡區中局部異常表達，而在周圍正常組織中沒有表達高峰，可以提示我們，抑制濾過泡瘢痕化，局部治療可能是必要而有效的。

本試驗CTGF蛋白定量分析試驗組中CTGF蛋白陽性顆粒的密度值和OD值隨術后時間變化都呈先升高后降低的變化。手術后第7天試驗組各值與對照組相比極顯著下降，手術后第5、7天各值的差別具有顯著性意義，對照組中密度值組間變化無統計學意義。表明CTGF與犬眼青光眼濾過術后濾過泡組織中瘢痕形成有關，這與唐衛華等[8]的試驗結果基本一致。我們的試驗研究證實了CTGF在青光眼濾過手術后濾過泡瘢痕形成過程中起到重要作用，假如能應用一些阻斷CTGF表達或抑制其生物活性的物質，選擇性地作用于CTGF靶位，可能更特異、更有效地抑制成纖維細胞增殖，防止青光眼濾過手術的失敗。

為了進一步探究CTGF在濾過泡瘢痕形成過程中的作用，術眼結膜瓣下分別注射0.2 mL CTGF液和0.2 mL生理鹽水。觀察濾過泡的情況和眼壓變化。試驗組濾過泡失敗時間為13.16±0.98 d，與對照組濾過泡失敗時間20.05±1.05 d比較，差別有統計學意義。證實了外源性CTGF的注入極顯著的提前了小梁切除術術后濾過泡的失敗時間，與唐衛華、汪昌運、柯美魁等人的相關研究一致[8]。進行小梁切除術后試驗組以及對照組術眼眼壓有明顯的降低，證明了小梁切除術能夠有效降低眼壓[9]。但術后第1、3、5、7、14、21天試驗組眼壓比對照組眼壓上升明顯，則表明了CTGF的注入加速濾過泡瘢痕的形成，導致濾過道阻塞從而使犬小梁切除術后眼壓升高。

綜上所述，在犬眼施行小梁切除術可以達到降低眼壓的效果。CTGF表達水平在手術后呈先升高后下降的變化，7 d達峰值。當外源性注入CTGF，加速了濾過泡瘢痕形成并導致眼壓升高。

參考文獻：

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[8] 唐衛華，汪昌運，柯美魁，等. 外源性結締組織生長因子在兔眼小梁切除術后濾過泡瘢痕形成中的作用[J].臨床眼科雜志，2009，8(2)：178-180.

[9] 姚琳，王大博，白海青，等. 結締組織生長因子在兔眼結膜下組織創傷愈合過程中的表達[J].眼科研究，2008，26(11)：837-840.