鹽酸克倫特羅多克隆抗體和量子點(diǎn)的偶聯(lián)

金艷丹 ， 栗 慧 ， 張巖蔚 ， 魏 東

(1.河北省農(nóng)產(chǎn)品安全檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 張家口 075000 ； 2.河北北方學(xué)院食品安全研究中心 ， 河北 張家口 075000)

鹽酸克倫特羅又稱“瘦肉精”(CL)，是白色或類白色晶體粉狀，無嗅、味微苦，化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，屬于苯乙醇胺類β2腎上腺類神經(jīng)興奮劑。它有較強(qiáng)的藥性，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，溶解代謝率低，不易排出，殘留量較高，大量用在飼料中可增強(qiáng)脂肪分解，肉迅速增長，大大提高了瘦肉率，增加瘦肉產(chǎn)量，雖說農(nóng)藥、飼料添加劑、動(dòng)物激素等在一定劑量范圍內(nèi)使用，可以為畜牧業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展起一定的促進(jìn)作用，但當(dāng)其在生物體內(nèi)含量超過臨床用量的5～10倍時(shí)，便會(huì)導(dǎo)致畜禽中毒和大量藥物殘留，帶來了相應(yīng)的安全隱患[1]。研究表明，過多食用含有瘦肉精的肉制品對人體某些機(jī)能損害極大，易使人出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、嘔吐等癥狀，特別是對高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡[2]。因此，研究一種高效、快速、簡捷的檢測鹽酸克倫特羅類興奮劑藥物殘留的方法是目前關(guān)鍵任務(wù)。

目前, 已經(jīng)有多種技術(shù)可以對鹽酸克倫特羅瘦肉精殘留進(jìn)行較為靈敏的檢測。主要有高效液相色譜[3]、微生物法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法[5]、膠體金免疫法[6]等，其中高效液相色譜法已成為多個(gè)國家主要的檢測方式，但該方法前處理比較復(fù)雜，所需儀器昂貴，難以普及。微生物法檢測線過高，靈敏度低，特異性差，適合于初級(jí)的篩選也無法廣泛適用。酶聯(lián)免疫吸附法目前雖備受關(guān)注但也存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺點(diǎn)，無法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測[7]。膠體金層析法雖比其他方法更適用但對于殘留量較低的半抗原抗體物質(zhì)仍舊很難進(jìn)行定量分析，且很不能用肉眼觀察，極大地限制了他的應(yīng)用[8]。而近年來新興的半導(dǎo)體納米熒光材料量子點(diǎn)逐漸被人們開發(fā)作為熒光材料標(biāo)記抗體，與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比激發(fā)光譜寬，顏色可調(diào)，穩(wěn)定性好，熒光強(qiáng)度高[9]。與膠體金相比量子點(diǎn)能檢測出含量較低的抗原抗體，靈敏度更高，更適用于藥物殘留的基層檢驗(yàn)和大量樣品直接現(xiàn)場檢測[10]。在免疫層析技術(shù)中，量子點(diǎn)與大分子物質(zhì)偶聯(lián)是建立熒光免疫層析法的基礎(chǔ)，因此本試驗(yàn)主要以鹽酸克倫特羅為研究對象，針對量子點(diǎn)的熒光性和抗體的生物功能，采用EDC/NHS偶聯(lián)劑將二者共價(jià)偶聯(lián)到一起，并經(jīng)紫外掃描法、熒光掃描、斑點(diǎn)法及免疫法對二者偶聯(lián)效果進(jìn)行了鑒定，為新型免疫層析法和多殘留檢測試劑盒的研制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑 鹽酸克倫特羅、碳亞二胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG，Sigma 公司生產(chǎn)；羊血清、鹽酸克倫特羅完全抗原、鹽酸克倫特羅多克隆抗體，河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)室自制；水溶性羧基量子點(diǎn)，北京北達(dá)聚邦量子點(diǎn)有限公司生產(chǎn)；TMB單組份顯色液，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)；其他試劑均為分析純由國藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，本次試驗(yàn)所用水均為超純水。

1.2 儀器 手持移液器(Research Plus系列)，艾本德國際貿(mào)易有限公司生產(chǎn)；電子精密天平(JJ323BC)常熟市雙杰測試儀器廠生產(chǎn)；臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-16A)，金壇市儀都儀器有限公司生產(chǎn)；紫外分光光度計(jì)(Lambda 365)，韓國生產(chǎn)；熒光分光光度計(jì)(F-7 000)，日本島津生產(chǎn)；微孔板恒溫孵育箱(ST70-2)，深圳市優(yōu)米儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；恒溫鼓風(fēng)干燥箱(FX101-3)，上海樹立儀器儀表有限公司生產(chǎn)；NC膜(0.8 μmol/L)，上海金標(biāo)生物科技有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀(Multiskan Mk3型)，賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

2 方法

2.1 量子點(diǎn)和鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián) 用注射器取600 μL水溶性羧基量子點(diǎn)溶液(2.5 μmol/L)加入1 mL的PBS(磷酸鹽緩沖液)(pH值=7.0) 攪拌均勻，邊攪拌邊加入300 μL EDC(6 mg/L),將量子點(diǎn)活化20 min后加入100 μL NHS(6 mg/L)，繼續(xù)28 ℃下攪拌20 min，最后加入750 μL鹽酸克倫特羅多克隆抗體溶液，于28 ℃反應(yīng)2.5 h。反應(yīng)結(jié)束后將偶聯(lián)物用超濾離心管在12 000 r/min條件下離心3 min，將樣品反復(fù)濃縮純化5次，每次濃縮比不小于10，最后置于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中于4 ℃避光保存。

2.2 偶聯(lián)效果的檢測

2.2.1 紫外分光光度計(jì)分析 將量子點(diǎn)和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體偶聯(lián)物用PBS(pH值=7.0)稀釋到一定濃度，在波長為400～700 nm范圍內(nèi)用UV3 900紫外掃描儀分別進(jìn)行掃描，觀察量子點(diǎn)和量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)物之間吸光度以及吸收光譜的變化。

2.2.2 熒光分光光度計(jì)分析 將量子點(diǎn)和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體偶聯(lián)物用PBS(pH值=7.0)稀釋到一定濃度，激發(fā)波長為540 nm，狹縫為10 nm，發(fā)射波長在400～700 nm范圍內(nèi)分別用熒光分光光度計(jì)掃描儀分別進(jìn)行掃描，測定熒光強(qiáng)度，觀察兩者之間的變化。

2.2.3 斑點(diǎn)印跡法 將6 mg/mL CL-OVA點(diǎn)在NC膜上，干燥后用含3% 羊血清的PBS(pH值=7.0)封閉膜上未反應(yīng)的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，放置37 ℃恒溫孵育箱中孵育1h，取出，用PBS或PBST反復(fù)洗滌膜。用相同方法制備2個(gè)印跡膜，干燥后依次滴加QDS-CL和QDS，于 37 ℃ 孵育器中反應(yīng)25 min，用PBS(pH值=7.0)反復(fù)沖洗干凈，用365 nm紫外燈觀察圖像。

2.2.4 熒光免疫學(xué)法 根據(jù)間接熒光免疫分析法測定已標(biāo)記水溶性羧基量子點(diǎn)的鹽酸克倫特羅多克隆抗體效價(jià)，具體步驟如下：包被、封閉、熒光抗體、二抗、顯色、終止、最后在450 nm下測OD值。

3 結(jié)果

3.1 紫外光譜圖 圖1為量子點(diǎn)與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的吸收光譜圖。由圖可知，量子點(diǎn)具有較寬的紫外吸收峰，而抗體標(biāo)記后的量子點(diǎn)的紫外吸收峰變得更寬，原因可能是由于量子點(diǎn)標(biāo)記上了抗體后，分子結(jié)構(gòu)及數(shù)量可能發(fā)生了改變，使得吸收峰變得更寬。偶聯(lián)后吸光度也有所增加，原因可能是量子點(diǎn)和抗體在EDC、NHS共價(jià)偶聯(lián)作用下，形成了酰胺鍵，并且形成了核殼結(jié)構(gòu)，降低了量子點(diǎn)表面核電荷數(shù)的減少，消除了一部分非輻射馳豫途徑從而使吸光度增大。

3.2 熒光光譜圖 圖2為圖2量子點(diǎn)與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的熒光光譜圖。由圖可知，用抗體標(biāo)記后的量子點(diǎn)，熒光吸收峰仍然很窄，最大吸收峰從560 nm到560.1 nm，熒光強(qiáng)度由652.3 nm增加到726.4 nm,略有增強(qiáng)。原因可能是由于量子點(diǎn)均勻的標(biāo)記上了鹽酸克倫特羅多克隆抗體，偶聯(lián)物粒徑變大，導(dǎo)致了熒光紅移現(xiàn)象。并且抗體包覆量子點(diǎn)后，其表面產(chǎn)生了一定的鈍化作用，降低了無輻射躍遷的幾率量子點(diǎn)偶聯(lián)物熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖1 量子點(diǎn)與鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的吸收光譜

圖2 鹽酸克倫特羅沙丁胺醇抗體偶聯(lián)前后的熒光光譜

3.3 斑點(diǎn)法 將制備好的NC膜放在三用紫外分析儀中觀察，結(jié)果見圖3所示，左膜在滴加CL-BSA 處有明顯的橙黃色亮斑，右膜在 CL-BSA 滴加處沒有出現(xiàn)橙黃色亮斑，結(jié)果表明，所制得的量子點(diǎn)與鹽酸克倫特羅多克隆抗體偶聯(lián)后，抗體并沒有喪失識(shí)別抗原的特異性能力，呈現(xiàn)橙黃色亮斑。而膜2由于NC膜上由于沒有抗體不能和抗原結(jié)合而被洗滌液洗掉，不顯示亮斑，有點(diǎn)殘留印跡。

圖3 量子點(diǎn)和鹽酸克倫特羅抗體偶聯(lián)前后的斑點(diǎn)

3.4 免疫學(xué)方法 用水溶性羧基量子點(diǎn)和鹽酸克倫特羅多克隆抗體偶聯(lián)物進(jìn)行間接熒光免疫法所得抗血清效價(jià)略有降低但仍可達(dá)32 000以上(P/N>2.1且P-N>0.2)，同時(shí)OD450值也呈良好的線性關(guān)系。因此說明量子點(diǎn)已經(jīng)成功標(biāo)在了鹽酸克倫特羅多克隆抗體上且多克隆抗體的生物活性沒有受到很大的影響，可為下一步試驗(yàn)提供參考依據(jù)。

4 討論

4.1 熒光材料的選擇 目前常用的熒光染料有熒光素類、羅丹明類染料、量子點(diǎn)。熒光素的雖然穩(wěn)定性好，量子產(chǎn)率高，但熒光素的斯托克斯位移較小，對樣品的發(fā)射光比較敏感。羅丹明類染料樣品背景干擾小但熒光產(chǎn)率小，而近年來新興的半導(dǎo)體熒光納米材料量子點(diǎn)不僅具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光產(chǎn)率高、肉眼易觀察等特性，還容易與蛋白質(zhì)共價(jià)偶聯(lián)，偶聯(lián)物穩(wěn)定性較強(qiáng)更適合長時(shí)間對半抗原樣品進(jìn)行定量分析。因此本試驗(yàn)選擇量子點(diǎn)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有機(jī)染料作為熒光染料標(biāo)記抗體。

4.2 偶聯(lián)方法的選擇 常見的偶聯(lián)方法有靜電吸引法、生物素-親和素法、雙功能連接試劑法。靜電吸引法是通過正負(fù)電荷的吸引作用將兩個(gè)物質(zhì)連接起來，該方法需要試劑種類少、操作方法簡單，而且偶聯(lián)效果也良好，多用于分子生物學(xué)，但需要用到重組技術(shù)儀器設(shè)備比較昂貴，且對外部環(huán)境較敏感不利于大范圍內(nèi)推廣使用。生物素-親和素法放大了生物素和親和素的共同效應(yīng)，可用于抗原抗體的定量分析，方便快速但其內(nèi)源性生物素的活性不易消除，容易影響結(jié)果。雙功能連接試劑法是采用一種具有2個(gè)或2個(gè)以上特殊基團(tuán)的反應(yīng)末端的雙功能偶聯(lián)劑將蛋白和小分子或者熒光材料連接到一起的方法。常用的交聯(lián)劑有N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸硫磺基琥珀酰亞胺脂鈉(sulfo-SMCC)。由于EDC具有很好的活化功能，NHS會(huì)增加基團(tuán)活化，但會(huì)輕微導(dǎo)致熒光淬滅。因此，本試驗(yàn)采用EDC先將量子點(diǎn)上的羧基活化再加入少量NHS，這樣不僅是量子點(diǎn)和抗體更好的結(jié)合，也不會(huì)因?yàn)镹HS過量導(dǎo)致熒光淬滅，形成較為穩(wěn)定的量子點(diǎn)和抗體偶聯(lián)物

4.3 偶聯(lián)物鑒定方法的選擇 量子點(diǎn)和多克隆抗體偶聯(lián)物鑒定的方法有紫外掃描法、熒光掃描法、斑點(diǎn)印跡法、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法、免疫學(xué)方法等等，紫外掃描法是指通過根據(jù)在一定波長范圍內(nèi)掃描的紫外吸收光譜來分析量子點(diǎn)及其量子點(diǎn)多克隆抗體的偶聯(lián)物的情況，一般來說量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)物由于連上了抗體分子量一定會(huì)有所增加，其吸收光譜也會(huì)發(fā)生一定的變化，因此，來初步判斷量子點(diǎn)是否成功標(biāo)記在了量子點(diǎn)上；熒光掃描法是量子點(diǎn)及其偶聯(lián)物在同一激發(fā)波長下使量子點(diǎn)及其偶聯(lián)物在一定范圍內(nèi)發(fā)射一定的波長后波峰會(huì)發(fā)生一定的改變，熒光強(qiáng)度可能增加或降低來鑒定偶聯(lián)效果；斑點(diǎn)印跡法實(shí)施根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理，使熒光抗體和包被的抗原發(fā)生反應(yīng)，在通過洗滌除去未反應(yīng)的分子，最后通過觀察顏色變化來進(jìn)一步判斷量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)物是否偶聯(lián)成功；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法是依靠表面活性劑十二烷基硫酸鈉(C12H25-OSO3Na)，將蛋白質(zhì)的某些氫鍵、疏水鍵打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，去掉電荷效應(yīng)最后根據(jù)遷移率得出分子量，鑒定抗體上是否偶聯(lián)了量子點(diǎn)；瓊脂糖凝膠電泳依據(jù)它自身產(chǎn)生的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)以瓊脂糖作為電泳介質(zhì)。根據(jù)不同電荷在電場中受力不同而產(chǎn)生不同的泳道把物質(zhì)分開來鑒別是什么物質(zhì)；免疫學(xué)方法是通過間接法來測定偶聯(lián)抗體的效價(jià)，來分析量子點(diǎn)抗體偶聯(lián)是否成功。因?yàn)殡娪痉ú僮鲿r(shí)間長且過程繁瑣到導(dǎo)致操作起來不方便且毒性大，所以本試驗(yàn)綜合各方面考慮選擇了紫外熒光掃描法、熒光掃描法、斑點(diǎn)印跡法、免疫學(xué)這4種方法來鑒定量子點(diǎn)是否成功標(biāo)記在了鹽酸克倫特羅多克隆抗體上。

5 結(jié)論

本試驗(yàn)通過EDC(碳亞二胺)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)偶聯(lián)劑的活化作用將純化后的CdTe/ZnS量子點(diǎn)和鹽酸克倫特羅多克隆抗體共價(jià)偶聯(lián)成熒光復(fù)合物，并經(jīng)過紫外分光光度計(jì)分別掃描其最大吸收峰、熒光分光光度計(jì)掃描其發(fā)射峰和熒光強(qiáng)度、斑點(diǎn)法觀察抗原抗體特異性結(jié)合現(xiàn)象鑒定了水溶性羧基量子點(diǎn)穩(wěn)定的熒光特性，抗體的生物活性，證明了量子點(diǎn)成功標(biāo)記了抗體，總之，本次研究結(jié)果可進(jìn)行下一步試驗(yàn)，為多殘留檢測試劑盒和試紙條應(yīng)用研究提供了重要的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 曹碧云. 三聚氰胺、沙丁胺醇及苯乙醇胺A的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)的研究和應(yīng)用[D].江蘇：蘇州大學(xué),2013.

[2] 路平,肖肖,張衍海,等. 我國“瘦肉精”監(jiān)管現(xiàn)狀分析及對策建議[J].中國動(dòng)物檢疫，2011，28(4)：4-6.

[3] 張玉蘭. 四環(huán)素、沙丁胺醇、特布他林酶聯(lián)免疫吸附測定法的建立[D].濟(jì)南：山東大學(xué),2007.

[4] 湯軼偉,王碩,勵(lì)建榮,等. β-興奮劑鹽酸克倫特羅殘留檢測方法最新研究進(jìn)展[J]. 中國食品學(xué)報(bào),2013,13(05):158-164.

[5] 韓森,馬國霞,李衛(wèi)芬. 鹽酸克倫特羅檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 畜牧與飼料科學(xué)(奶牛版),2006,27(02):33-35.

[6] 姜艷彬,孫冠如,王海,等. 鹽酸克倫特羅膠體金快速檢測試紙條的研制[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2010,37(10):109-113.

[7] 張清安,范學(xué)輝. 動(dòng)物性食品中鹽酸克倫特羅(瘦肉精)殘留危害及其檢測方法研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2004,34(09):108-111+119.

[8] 宋春美. 基于熒光納米顆粒標(biāo)記的鹽酸克倫特羅熒光免疫層析試紙的研究[D].無錫，江南大學(xué),2013.

[9] 李淑群. 基于膠體金和量子點(diǎn)免疫層析技術(shù)的研究及應(yīng)用[D].蘇州：蘇州大學(xué),2013.

[10] 李眾,祝欣,董朝青,等. 熒光量子點(diǎn)的水相合成及其在化學(xué)和生物分析中的應(yīng)用[J]. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2010,10:1 905-1 915.