可視環介導恒溫擴增技術檢測實驗猴小腸結腸炎耶爾森菌

溫和心 ， 龍英全 ， 蔣榮華 ， 盤寶進 ， 羅廣生 ， 陳立軍

(1.貴港出入境檢驗檢疫局 ， 廣西 貴港 537100 ； 2.靈長類實驗動物國家重點實驗室 , 廣西 南寧 530028；3.玉林出入境檢驗檢疫局 ， 廣西 玉林 530000)

小腸結腸炎耶爾森菌能致人和其他多種動物發生胃腸炎、關節炎、敗血癥及結節性紅斑等病，是非常重要的人獸共患病病原。該細菌在我國的分布非常廣，從人群、動物、外環境和食品都可以分離出病原菌[1]。該病與人們日常生活關系密切，流行病學研究表明，小腸結腸炎耶爾森菌能在冷藏溫度下生長繁殖，故冰箱是耶爾森菌小腸結腸炎重要的傳染源，俗稱“冰箱菌”。本自治區是實驗猴出口大省，國際一些進口國逐漸對猴小腸結腸炎耶爾森菌提出檢疫要求。該細菌主要以分離培養方法進行檢驗，從低溫增菌到確定細菌的血清型、生物型大約需要1周的時間，耗時較長[2]，無法滿足檢疫要求。可視環介導恒溫擴增檢測技術是在LAMP體系中加入指示劑，可以目測反應結果，既免除產物電泳步驟，又減少產物污染，克服LAMP技術易污染的缺點，更好地發揮LAMP技術的優勢。 把可視LAMP技術應用于小腸結腸炎耶爾森菌的快速檢測，解決當前小腸結腸炎耶爾森菌檢疫，意義重大。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 小腸結腸炎耶爾森菌CMCC5220，鼠疫耶爾森菌DNA(疫苗菌，憑祥出入境檢驗鼠疫國家重點實驗室贈)，假結核耶爾森菌CMCC53504，大腸桿菌ATCC25922，傷寒沙門菌CMCC50039，痢疾志賀菌ATCC51252，空腸彎曲桿菌ATCC33291，溶血性鏈球菌CMCC32121，李斯特菌ATCC19111，糞腸球菌ATCC35667，金黃色葡萄球菌ATCC6538，表皮葡萄球菌ATCC12228，銅綠假單胞菌ATCC27853，產氣莢膜梭菌ATCC13124，肺炎克雷伯菌CMCC46117，阪崎腸桿菌ATCC29544，奇異變形桿菌ATCC25933。

1.1.2 試劑與設備DNA大片段聚合酶試劑盒(Bst酶，Neb)，PCR試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；脫氧核苷酸(dNTP，天根生化科技(北京)有限公司)；羥基萘酚藍(HNB,Sigma公司)；甜菜堿(betaine,Sigma公司)；硫酸鎂(AR,Sigma公司)；礦物油(Sigma公司)；引物、探針(Lifetect公司)；熒光PCR儀(ABI7500)，PCR儀(ABISimpliAmp公司)；水浴鍋(上海—恒科技儀器有限公司，HWS24)；麥氏濁度儀(梅里埃(上海)生物制品有限公司，Densicheck)；紫外儀、電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠,WD-9403D、DDY-2C、DYCP-34)等。

1.1.3 小腸結腸炎耶爾森菌引物設計 引物序列信息見表1。

表1 小腸結腸炎耶爾森菌引物序列信息

1.2 方法

1.2.1 細菌濃度的標定和DNA的提取 從平皿中挑取小腸結腸炎耶爾森菌單個菌落，接種于3 mL的營養肉湯中，36 ℃培養過夜，8 000 r/min離心2 min，棄上清，沉淀用0.9%生理鹽水洗滌、離心1次，沉淀物用去離子水懸浮，用麥氏濁度法標定細菌濃度， 即1MCF≈3×108CFU/mL[4]。取菌液隔水煮沸15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清即為細菌DNA，冷凍備用。

1.2.2 LAMP反應體系高溫-低溫前處理試驗 設A和B 2個試驗組，A組將未添加Bst酶的反應體系先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、開蓋加入Bst酶并混勻，最后加入150 μL礦物油，密封管蓋，63 ℃水浴1.5 h，直接目測觀察結果。B組反應體系配制好后，直接63 ℃水浴1.5 h，目測觀察結果。A、B 2個試驗組同時檢測小腸結腸炎耶爾森菌DNA各稀釋度，比較兩個試驗組的靈敏度。

1.2.3 反應體系添加甜菜堿試驗 設A和B 2個試驗組，A組反應體系含有0.8 mol/L的濃度甜菜堿，B組反應體系不含甜菜堿，反應程序是反應體系(不含Bst酶)先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、開蓋加入Bst酶并混勻，最后加入150 μL礦物油，密封管蓋，63 ℃水浴1 h，直接目測觀察結果。A、B 2個試驗組同時檢測Y.e菌DNA各稀釋度，比較兩個試驗組的靈敏度。

1.2.4 PCR、熒光PCR、電泳LAMP、可視LAMP比較靈敏度試驗 PCR和熒光PCR反應體系、反應程序均按試劑盒說明書進行。LAMP反應體系見表2。

表2 LAMP反應體系

LAMP反應體系前處理：反應體系(不含Bst酶)先95 ℃水浴1 min，移至50 ℃水浴1 min,取出、開蓋加入Bst酶并混勻，最后加入150 μL液體石臘，密封管蓋。

LAMP反應程序：63 ℃水浴1 h，煮沸2 min終止反應，取4 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳，拍照分析結果。可視LAMP反應體系即是在LAMP反應體系基礎上加入2 mmol/L羥基萘酚藍(HNB)1.8 μL, 反應體系前處理與反應程序與LAMP相同，不進行產物電泳，直接目測觀察結果。上述4種方法檢測小腸結腸炎耶爾森菌DNA 各稀釋度，根據結果比較各方法的靈敏度。

1.2.5 可視LAMP特異性試驗 將假結核耶爾森菌、大腸桿菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、空腸彎曲桿菌、溶血性鏈球菌、李斯特菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、產氣夾膜梭菌、肺炎克雷伯菌、阪崎腸桿菌奇異變形桿菌13種常見的致病菌培養過夜，按1.2.1法將菌液稀釋至1MCF后，采用熱裂解法提取細菌DNA。用可視LAMP反應體系和反應程序，檢測各細菌DNA，檢驗可視LAMP特異性。

1.2.6 樣品基質干擾試驗設置2種采樣方式，取猴肛拭子、猴糞便2 g各1份置于10 mL增菌液中，36 ℃培養過夜，分別取上層增菌液3 mL備用。分別用增菌液按10倍遞增法稀釋1MCF濃度的小腸結腸炎耶爾森菌，將各個稀釋度的菌液離心，沉淀用去離子水洗滌1遍，最后用去離子水恢復至原體積，使沉淀完全懸浮。按1.2.1法熱裂解細菌提取DNA。用可視LAMP檢測所提取的DNA，比較樣品基質對試驗的干擾情況。

1.2.7 可視LAMP與分離鑒定法比較試驗 在實驗猴繁育場分別采用可視LAMP方法和分離鑒定方法—實驗動物耶爾森菌檢測方法(GB/T 14926.3-2001)檢測實驗猴小腸結腸炎耶爾森菌，統計兩種方法的檢驗結果，比較二者的檢出率和符合率。

2 結果

2.1 LAMP反應體系高溫-低溫前處理試驗結果

如中插彩版圖1所示，反應體系經過高溫-低溫前處理的A組敏感性是6 CFU/反應，未經過高溫-低溫前處理的B組敏感性只有600 CFU/反應，A組敏感性顯著高于B組，證明高溫DNA變性-低溫促使DNA與引物結合，可顯著提高可視LAMP方法的敏感性。

2.2 反應體系添加甜菜堿試驗結果 反應體系添加甜菜堿 A組敏感性是6 CFU/反應，未添加甜菜堿B組敏感性是60 CFU/反應，A組敏感性顯著高于B組，A、B均無假陽性產生，證明明甜菜堿是有助于促進DNA變性，打開雙鏈，創造引物與DNA結合的有利環境，所以反應體系中添加甜菜堿可顯著提高可視LAMP方法的敏感性。

2.3 PCR、熒光定量PCR、傳統LAMP、可視LAMP敏感性試驗結果 如中插彩版圖2-A顯示小腸結腸炎耶爾森氏菌fox基因的PCR擴增產物電泳結果，產物長度在300 bp左右，與目標基因311 bp相符，PCR擴增產物量隨模板量降低而減少，最低檢出限為60 CFU/反應。如中插彩版圖2-B顯示小腸結腸炎耶爾森菌Yst基因熒光定量PCR擴增擴增曲線，最低檢出限為6 CFU/反應。傳統LAMP和可視LAMP都可以對小腸結腸炎耶爾森菌PHOP基因有效地擴增，中插彩版圖2-C 顯示，LAMP擴增產物瓊脂糖凝膠電泳條帶呈典型的梯狀排列，最低檢出限為6 CFU/反應。中插彩版圖2-D結果顯示可視LAMP，陰性管保持藍紫色無變化，陽性管變成青藍色，最低檢出限為6 CFU/反應，證明指示劑羥基萘酚藍對LAMP反應無不良作用。 綜合以上結果表明，可視LAMP與熒光定量PCR、傳統LAMP方法檢測敏感性相當，都是6 CFU/反應，高于PCR法敏感性60 CFU/反應，可視LAMP目測判定結果，簡單明了，技術優勢明顯。

2.4 可視LAMP特異性試驗結果 中插彩版圖3顯示可視LAMP特異性試驗結果，只有小腸結腸炎耶爾森菌呈陽性反應，同屬的鼠疫耶爾森菌和假結核耶爾森菌呈陰性反應，大腸桿菌、糞腸球菌等腸道常見菌均呈陰性反應，表明該可視LAMP對小腸結腸炎耶爾森菌有較強的特異性。

2.5 樣品干擾試驗結果 樣品干擾試驗結果顯示，肛拭子組、猴糞便干擾組可視LAMP敏感性均達到6 CFU/反應，無假陽性，表明肛拭子、猴糞便增菌培養物對可視LAMP的敏感度和特異無明顯影響。

2.6 可視LAMP與分離鑒定法對比試驗結果 應用可視LAMP和分離鑒定法同時檢驗實驗猴肛拭子21批次共3 050頭份，結果分別檢出15份和9份陽性樣品，分離鑒定法9份陽性樣品包含于可視LAMP陽性樣品中，表明可視LAMP檢出率顯著高于分離鑒定法。不僅如此，可視LAMP法檢驗效率高于細菌分離鑒定法，結果判定直觀明了，可以顯著提高猴場小腸結腸炎耶爾菌檢疫技術水平。

3 結論

本研究的創新在于在環介導恒溫擴增反應體系中引入指示劑形成可視LAMP，根據反應管顏色變化判斷結果，減少了原有技術開蓋凝膠電泳步驟

和由此造成氣溶膠污染，使LAMP技術實用價值更高。本研究證明了對反應體系進行高溫-低溫變溫前處理、在反應體系中添加甜菜堿等措施均可顯著提高反應靈敏度。據此建立的可視LAMP檢測小腸結腸炎耶爾森菌方法的靈敏度與傳統LAMP相同，與熒光PCR相當，顯著高于PCR。該方法與小腸結腸炎耶爾森菌呈特異性反應，與耶爾森菌屬其他細菌和腸道常見菌呈陰性反應。反應受肛拭子或糞便樣品基質干擾不顯著。可見可視LAMP檢測小腸結腸炎耶爾森菌操作方便快捷，結果靈敏準確，設備要求簡單，特別適合基層或野外作業，是有推廣應用價值檢測技術。

參考文獻:

[1] 陳鄔錦,王鵬.中國小腸結腸炎耶爾森菌流行現狀及其研究進展[J].中國人獸共患病學報,2015，31(4):380-384.

[2] GB/T 14926.3-2001, 實驗動物耶爾森菌檢測方法[S].

[3] Li Y, Jiang M, Liu W,etal. Loop-mediated isothermal amplification method targets to the phoP gene for detection of Yersinia enterocolitica[J]. Molecular & Cellular Probes,2009,24(2):68-71.

[4] 中國藥典：二部[S]. 2010：附錄 93-98.