新城疫病毒致雞胚成纖維細胞病變特性研究

張桂枝 ， 靳雙星

(河南牧業經濟學院動物科技學院 ， 河南 鄭州 450046)

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起家禽的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，具有很高的發病率和死亡率，是危害養禽生產的一種重要傳染病，OIE將其列為A類疫病。新城疫病毒具有血凝素、神經氨酸酶和溶血素。近年來研究發現NDV感染后，可導致組織損傷、細胞病變、細胞融合、誘導宿主細胞凋亡等[1-2]。雞胚成纖維細胞(Chicken embryo fibroblast，CEF)被廣泛應用于細胞和分子生物學等許多方面的研究。

近年來研究發現，NDV存在很多變異株，不同毒株毒力差異較大，強毒株可在體外多種細胞中增殖，通過膜融合而感染宿主細胞[3]，而弱毒株只有在含有胰蛋白酶的細胞中才能增殖[4]。本研究通過新城疫Ⅰ系毒株和新城疫Ⅳ系毒株在CEF上增殖，以觀察病毒感染所致的細胞病變(CPE)和致病性的差異，旨在評價NDV對CEF的易感性，為NDV的分離鑒定、增殖及中藥提取物體外抗病毒效果研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 供試雞胚9～11日齡SPF雞胚由河南后羿生物工程有限公司提供。新城疫Ⅰ系疫苗、新城疫Ⅳ系疫苗由河南牧業經濟學院動物醫學院微生物實驗室提供。經SPF雞胚絨毛尿囊腔接種復壯，48 h收集病毒液，測定新城疫Ⅰ系毒株、新城疫Ⅳ系毒株的血凝(HA)效價分別為28和27，-20 ℃保存備用。主要儀器設備:細胞培養板為Costar公司產品；二氧化碳培養箱(Thermo公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)等。主要試劑:DMEM培養液(GIBCO)、新生牛血清(GIBCO)、胰蛋白酶(Invitrogen)等。

1.2 方法

1.2.1 雞胚成纖維細胞單層制備 無菌取出9～11日齡雞胚，剪去胚頭、爪、翅和內臟，用含有雙抗(青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL)Hank's液反復沖洗2～3次，剪成1 mm3大小碎塊，用0.25%胰蛋白酶消化組織塊20 min，然后傾去上層胰酶并用Hank's液洗滌2～3次，用含5%新生牛血清DMEM培養液終止消化，8層無菌紗布過濾，制成1×106/mL的CEF細胞懸液，加至96孔細胞培養板中，0.2 mL/孔，37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養至細胞長成單層，備用[5]。

1.2.2 雞胚成纖維細胞接種病毒及細胞形態觀察 CEF形成單層后，吸出培養液，用Hank's液反復沖洗2～3次，添加用維持液(含1%新生牛血清的DMEM培養液)稀釋的稀釋度分別為10-1～10-11病毒液0.1 mL/孔；設為4個試驗組，分別為新城疫Ⅳ系毒株組、新城疫Ⅰ系毒株組、新城疫Ⅳ系毒株胰酶組和新城疫Ⅰ系毒株胰酶組(胰蛋白酶含量均為25 μg/mL)，另設正常細胞對照(維持液0.2 mL/孔)。試驗組在37 ℃、CO2培養箱中吸附1 h，棄去病毒液，加入維持液0.2 mL/孔，繼續在37 ℃、 CO2培養箱中培養，分別于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h在倒置顯微鏡下觀察細胞與細胞形態變化，并拍照。

1.2.3 CEF培養上清液HA效價及病毒感染力測定 在細胞培養120 h后測定培養液中病毒血凝效價。按 Reed-Muench 公式計算半數細胞培養物感染量(TCID50)。

2 結果與分析

2.1 NDV致雞胚成纖維細胞病變觀察 由表1和圖1(見中插彩版)可知，經雞胚復壯的新城疫Ⅰ系毒株組和新城疫Ⅰ系毒株胰酶組以不同稀釋度接種細胞，均能在雞胚成纖維細胞上增殖，24 h后產生細胞病變，48 h產生典型的CPE，最初表現為細胞腫大，回縮變圓，折光性增強，形成較小的合胞體，細胞之間的空隙變大，但此時細胞單層結構基本完整；72 h發生細胞融合和形成多核巨細胞，殘留細胞呈拉網狀，折光性進一步增強，細胞變暗；96～120 h單層呈片狀脫落，漂浮于細胞培養液中。新城疫Ⅳ系毒株組，整個觀察期間未見典型的細胞病變，不產生CPE，細胞單層完整。而新城疫Ⅳ系毒株胰酶組，48 h后產生CPE，早期細胞腫大、變圓、回縮、邊界模糊；72 h后細胞病變逐漸明顯，胞漿內可見大小不等的空泡或顆粒，沒有典型的細胞融合或形成合胞體現象；96 h細胞單層基本完整，120 h細胞單層部分脫壁。

2.2 CEF培養上清液HA效價及病毒感染力測定 由表2可知，不同稀釋度的新城疫Ⅳ系毒株組在不含胰酶的CEF上不產生CPE，CEF培養上清液也測不到HA效價；新城疫Ⅳ系毒株胰酶組CEF培養上清液最高HA效價為27；新城疫Ⅰ系毒株組、新城疫Ⅰ系毒株胰酶組CEF培養上清液最高HA效價高于新城疫Ⅳ系毒株胰酶組2個滴度，TCID50也明顯增高，證明新城疫Ⅰ系毒株在CEF細胞上的感染力強。

表1 不同處理方式對CEF 病變率的影響

表2 不同處理方式對CEF增殖的病毒HA效價、TCID50的影響

3 討論

細胞融合是副黏病毒感染細胞的一個重要生物學標志，也是病毒復制、致病作用的一個重要過程和手段[6]。在病毒復制過程中，融合蛋白前體F0裂解為F1和F2才能形成有感染性的子代病毒粒子，這一裂解過程是決定不同毒株毒力強弱的關鍵[7]。新城疫Ⅰ系毒株為中等毒力，不需要胰蛋白酶催化即能感染雞胚成纖維細胞，引起典型的CPE，這與NDV F蛋白的裂解位點密切相關，F蛋白裂解位點存在多個堿性氨基酸，有毒力NDV F蛋白的C端含有一對堿性氨基酸，能被宿主細胞內的多種蛋白酶識別和裂解，無需外源蛋白酶[7]。而新城疫Ⅳ系毒株需要胰蛋白酶協助才能在雞胚成纖維細胞中增殖，胰蛋白酶可以裂解所有的NDV的F0蛋白，體外處理無感染性的病毒可使其恢復感染性，新城疫Ⅳ系為低毒力毒株，只有在添加胰蛋白酶的情況下才能有效增殖[5]。胰蛋白酶可以識別新城疫Ⅳ系弱毒株的單個堿性氨基酸使F0裂解，另外胰蛋白酶也可松散細胞間的緊密結合，暴露唾液酸受體，有利于病毒與細胞的結合。本試驗表明，在細胞維持液中添加25 μg/mL胰蛋白酶能有效地促進新城疫Ⅳ系雞胚毒在CEF上的增殖，與新城疫Ⅰ系雞胚毒株相比，對CEF的致病變特性存在明顯差異。具體表現在：新城疫Ⅳ系雞胚毒在胰蛋白酶協助下致CEF變性、壞死、裂解過程緩慢，主要以胞漿內可見大小不等的空泡或顆粒為特征，沒有典型的細胞融合或形成合胞體現象；新城疫Ⅳ系雞胚毒感染CEF后，上清中的病毒HA最高效價比新城疫Ⅰ系雞胚毒株低2個滴度，TCID50也較低。這些結果提示，新城疫Ⅰ系雞胚毒株比新城疫Ⅳ系雞胚毒具有更強的促細胞融合能力和感染力。

參考文獻：

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[2] 崔玉東, 冉旭華, 宋佰芬, 等.新城疫病毒Ⅰ系毒株通過Caspase途徑誘導雞胚成纖維細胞凋亡[J] .中國獸醫學報, 2006，26(3):254-256.

[3] 任桂杰,王志玉.副粘病毒包膜蛋白分子生物學研究進展[J].病毒學報,2005，21(1):72-75.

[4] 金繼昌,趙立紅,喬健,等.NDV-Lasota毒株在雞胚成纖維細胞上的增殖特性[J].實驗動物科學,2007,24(3):20-23.

[5] 王曉旭,孫英杰,胡躍等.新城疫病毒誘導原代雞胚成纖維細胞自噬的研究[J].中國獸醫科學,2014,44(05):446-452.

[6] 豆艷麗,吳潤,劉磊.雞新城疫病毒感染不同細胞的病變特性研究[J].甘肅農業大學學報,2012,47(2):1-5.

[7] Peeters B P, Deleeuw O S , Koch G.Rescue of Newcastle disease virusfrom cloned cDNA :evidence that cleavability of the fusion protein is amajor determinant for Virulence[J]. Viral,1999,73(6):5 001-5 009.