棘阿米巴表達(dá)文庫(kù)的免疫學(xué)篩選

張宏梅 ， 鄭文彧 ， 劉 迪 ， 時(shí)文艷 ， 孫宏宇 ， 崔佰吉 ， 高俊濤 ， 馮憲敏

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院病原生物學(xué)教研室 ， 吉林 吉林 132013 ； 2.吉林市中心醫(yī)院 ， 吉林 吉林 132000)

棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba Keratitis，AK)是一種嚴(yán)重威脅視力的感染性眼病, 其發(fā)生與一定的危險(xiǎn)因素有關(guān)，如配戴角膜接觸鏡、接觸污染的水源、角膜輕度擦傷，以及機(jī)體抵抗力降低等[1-2]。目前為止，對(duì)棘阿米巴原蟲(chóng)的研究主要集中在形態(tài)分型、基因分型、藥物殺傷試驗(yàn)、感染模型和致病機(jī)制研究階段，對(duì)于棘阿米巴角膜炎的病因?qū)W、免疫學(xué)、病理生理學(xué)以及診斷治療等方面的研究仍有待深入。在前期工作中，課題組成功構(gòu)建了棘阿米巴原蟲(chóng)滋養(yǎng)體全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)[3]和棘阿米巴角膜炎的兔模型[4]。本文通過(guò)棘阿米巴感染兔血清對(duì)構(gòu)建好棘阿米巴原蟲(chóng)滋養(yǎng)體全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選，以期獲得高反應(yīng)原性的抗原基因，為進(jìn)一步棘阿米巴原蟲(chóng)感染的快速診斷試劑和免疫預(yù)防分子的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株 棘阿米巴原蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)蟲(chóng)株(Acanthamoebahealyi)由延邊大學(xué)病原教研室惠贈(zèng)，本室凍存。將棘阿米巴原蟲(chóng)純培養(yǎng)于蛋白胨-酵母-葡萄糖培養(yǎng)基(Peptone-Yeast-Glucose, PYG)中, 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的滋養(yǎng)體， 生理鹽水調(diào)整原蟲(chóng)濃度為1×106/mL(90%以上滋養(yǎng)體)，并用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)蟲(chóng)體活力>90%，用于試驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器 棘阿米巴cDNA和原始cDNA文庫(kù)由本室制備，-80 ℃冷凍保存[3]。E.coliXL1-Blue，PBST，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG，RNA提取試劑盒，cDNA合成試劑盒，2×TaqPCR Green Mix，引物，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒。

1.3 免疫血清制備

1.3.1 感染兔模型 健康新西蘭白兔6只(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重2.0～2.5 kg，雌雄兼用。試驗(yàn)組4只，對(duì)照組2只。試驗(yàn)組單眼注射，左眼為試驗(yàn)眼,右眼為病變對(duì)照眼。實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)眼用0.5%氫化可的松滴眼液點(diǎn)眼, 每天3～4次，共3 d。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后,停用激素。試驗(yàn)組兔固定后，經(jīng)氯胺酮肌肉注射全麻后，左眼再經(jīng)0.5%可卡因點(diǎn)眼局麻,用1 mL無(wú)菌注射器向?qū)嶒?yàn)眼角膜基質(zhì)內(nèi)注射棘阿米巴原蟲(chóng)混懸液0.2 mL(1×106/mL)，2只對(duì)照兔左眼角膜基質(zhì)內(nèi)注射等量生理鹽水，右眼未做處理。于注射12 h開(kāi)始，每天觀察兔眼角膜病變情況，直到處死(42 d)[5]。

1.3.2 10%氫氧化鉀濕封片鏡檢 分別于注射后3 d、7 d、14 d及28 d，刮取兔角膜較深層病變組織涂于滴加10%KOH的載玻片上，置于光學(xué)顯微鏡下查找滋養(yǎng)體或包囊。

1.3.3 血清抗體滴度檢測(cè) 分別于感染后第1、7、14、21、28、35、42天耳緣靜脈或動(dòng)脈取血，制備血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)兔血清中抗棘阿米巴原蟲(chóng)抗體的滴度。將棘阿米巴蟲(chóng)體粗抗原(濃度為1.63 2 mg/mL)稀釋至10 μg/mL，按每孔100 μL包被96孔板，4 ℃過(guò)夜。次日用0.05 mol/L pH值7.4的PBS-Tween-20(PBST)洗液洗滌3次，每次5 min；3%脫脂奶粉每孔100 μL封閉1 h，PBST洗滌后，加入稀釋的兔血清(1∶4 000,1∶8 000,1∶16 000, 1∶32 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗滌后，加入1∶5 000稀釋的二抗(bs-0295G-HRP rabbit IgG/HRP，公司)，37 ℃孵育5 h；PBST洗滌后，以TMB為底物顯色10 min，4 mol/L硫酸終止反應(yīng)，用bio-rad 680酶標(biāo)儀(美國(guó))測(cè)定OD450值。

1.4 cDNA文庫(kù)滴度測(cè)定 取1 μL原始文庫(kù)，用1×λ dilution Buffer 分別進(jìn)行1×10-3、1×10-4和1×10-5倍稀釋。從每個(gè)濃度分別吸取1 μL加入至100 μLE.coliXL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃孵育15 min。將上述混合液與6 mL LB/MgSO4/麥芽糖軟頂瓊脂混合后傾注平板，室溫冷卻，于37 ℃培養(yǎng)16～18 h。計(jì)數(shù)溶菌斑數(shù)量，以確定該文庫(kù)的滴度。

1.5 cDNA文庫(kù)免疫篩選 1×10-3稀釋的棘阿米巴cDNA文庫(kù)0.5 μL，加入至100μLE.coliXL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃孵育15 min。將上述混合液與6 mL LB/MgSO4/麥芽糖軟頂瓊脂混合后傾注平板，室溫冷卻，于37 ℃培養(yǎng)16～18 h，至噬菌斑清晰可見(jiàn)，未融合。將預(yù)先準(zhǔn)備好的140 mm直徑的PVDF膜覆蓋于噬菌斑表面，標(biāo)記固定，37 ℃正置孵育4 h，4 ℃倒置過(guò)夜。取下PVDF膜，PBST洗滌3次后，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，洗滌后首抗和二抗各自孵育1 h，DAB顯色。首抗：分別取1 μL感染后第7、14、21天和28天兔血清，混合后，與E.coliXL1-Blue裂解液室溫混合過(guò)夜；次日2 000×g，室溫離心10 min，收集上清，用抗體稀釋液進(jìn)行1∶5000 稀釋。二抗：辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG，使用濃度1∶500。從培養(yǎng)板上挑取陽(yáng)性克隆置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 1×λdilution Buffer，4 ℃過(guò)夜；次日離心取上清進(jìn)行復(fù)篩和測(cè)序。

1.6 陽(yáng)性克隆測(cè)序與序列分析 將上述噬菌體溶液送北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司采用通用引物T3和T7進(jìn)行雙向測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，采用ORF finder軟件進(jìn)行ORF預(yù)測(cè),并對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行Blastp同源性分析。同時(shí)根據(jù)堿基序列設(shè)計(jì)特異性引物，以棘阿米巴cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Green Mix，12.5 μL；Ameba cDNA，0.5 μL；引物F/R各1 μL；無(wú)核酸酶的去離子水至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；92 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠，進(jìn)行電泳，PCR產(chǎn)物回收，進(jìn)行二次測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 免疫兔血清制備 在家兔角膜感染棘阿米巴原蟲(chóng)后3、7、14 d及28 d分別作角膜深層組織刮片，滴加10%KOH，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，4只試驗(yàn)眼均查見(jiàn)滋養(yǎng)體或包囊(圖未列出)，表明感染模型構(gòu)建成功。

分別于感染后第1、7、14、21、28、35、42天耳緣靜脈或動(dòng)脈取血，制備血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)兔血清中抗棘阿米巴原蟲(chóng)抗體的滴度。隨著感染的進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)組兔血清抗體水平于感染后的第7天開(kāi)始逐漸升高，第28天達(dá)到峰值，而后抗體滴度開(kāi)始緩慢下降；陰性對(duì)照組兔血清抗體水平?jīng)]有明顯變化(圖1)。根據(jù)抗體水平的變化，選用感染后第7、14、21天和28天兔血清進(jìn)行文庫(kù)的免疫學(xué)篩選。

圖1 兔棘阿米巴角膜炎模型血清抗體滴度的變化

2.2 cDNA文庫(kù)的免疫學(xué)篩選和序列分析 對(duì)培養(yǎng)板上的噬菌斑進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出cDNA文庫(kù)滴度為3.88×107PFU/mL。用預(yù)吸附的感染兔血清對(duì)棘阿米巴原蟲(chóng)cDNA文庫(kù)進(jìn)行初篩和復(fù)篩，獲得3個(gè)持續(xù)陽(yáng)性克隆(圖2)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，采用NCBI-Blastp對(duì)氨基酸序列的同源性進(jìn)行比對(duì)。如表1顯示，克隆1插入序列長(zhǎng)度為956 bp，含有一個(gè)774 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼258個(gè)氨基酸，分子量大小為29.13 kDa，GenBank注釋為肌動(dòng)蛋白1(actin1)；克隆2插入序列長(zhǎng)度為658 bp，含有一個(gè)234 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼78個(gè)氨基酸，分子量大小為8.96 kDa，GenBank注釋為聚泛素(polyubiquitin)；克隆3插入序列長(zhǎng)度為1 290 bp，含有一個(gè)564 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼188個(gè)氨基酸，分子量大小為21.36 kDa，GenBank注釋為熱休克蛋白20(HSP20)。

表1 3個(gè)陽(yáng)性克隆序列比對(duì)分析

圖2 棘阿米巴cDNA文庫(kù)的免疫學(xué)篩選

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物，以棘阿米巴原蟲(chóng)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，結(jié)果顯示，3個(gè)陽(yáng)性克隆全部擴(kuò)增出特異條帶，插入的cDNA片段大小分別為774 bp、234 bp和564 bp(圖3)，與序列比對(duì)結(jié)果一致。

3 討論

棘阿米巴角膜炎(AK)是由自由生棘阿米巴原蟲(chóng)感染引起的一種致盲性眼病。其發(fā)生與一定的危險(xiǎn)因素有關(guān)，如佩戴角膜接觸鏡、接觸污染的水源、角膜擦傷、眼部外科手術(shù)以及機(jī)體抵抗力降低等。棘阿米巴原蟲(chóng)的生活史包括滋養(yǎng)體和包囊兩個(gè)階段，滋養(yǎng)體的繁殖速度極快，感染包囊3 d內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)樽甜B(yǎng)體，侵入組織或經(jīng)過(guò)治療后又可以轉(zhuǎn)變成包囊，包囊抵抗力極強(qiáng)，不易被殺滅，故該病治療預(yù)后不良[6-9]。臨床診斷的標(biāo)準(zhǔn)為病原學(xué)診斷，其樣本的采集主要為角膜刮片，診斷率低，不易被患者所接受。此外，由于AK患者早期癥狀不特異，臨床上容易和病毒性或真菌性角膜炎混淆，發(fā)生漏診、誤診和誤治，導(dǎo)致疾病的惡化[10-11]。因此對(duì)AK感染的預(yù)防和早期診斷一直是亟待解決的問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的發(fā)展，基因工程重組診斷抗原和分子疫苗的研究成為診斷試劑，以及疫苗研發(fā)的重要手段。cDNA表達(dá)文庫(kù)和感染血清篩選是分離和鑒定抗原候選基因的常用方法之一。

前期工作中，課題組通過(guò)SMART法構(gòu)建了棘阿米巴原蟲(chóng)的cDNA表達(dá)文庫(kù)。在本研究中通過(guò)角膜注射構(gòu)建棘阿米巴角膜炎兔模型，并獲得用于文庫(kù)免疫學(xué)篩選的感染血清。根據(jù)抗體滴度的變化規(guī)律，選用感染后第7、14、21天和第28天的混合血清，去除E.coliXL1-Blue交叉反應(yīng)性后，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選。經(jīng)過(guò)三輪的初篩和復(fù)篩，共得到6個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物可以與感染血清發(fā)生特異性結(jié)合。經(jīng)序列比對(duì)后，其中3個(gè)基因(actin1、polyubiquitin和HSP20)在棘阿米巴原蟲(chóng)基因庫(kù)中具有明確的注釋。為進(jìn)一步的基因克隆，原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定，以及AK的免疫診斷和疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)，但三者在棘阿米巴入侵和致病過(guò)程中的作用有待進(jìn)一步研究。

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