高效液相色譜法測定小兒化毒膠囊人工牛黃中膽紅素含量

趙珊珊 ，羅定強 ，吳 芳 ，劉海靜 ，△

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046； 2.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710061）

小兒化毒膠囊由人工牛黃、珍珠、雄黃、大黃、黃連、甘草、天花粉、川貝母、赤芍、乳香（制）、沒藥（制）、冰片 12 味中藥組方，具有清熱解毒、活血消腫的功效。該藥為西安碑林藥業股份有限公司獨家生產，質量標準收載于國家食品藥品監督管理總局《國家藥品標準·新藥轉正標準(第50冊)》，處方中原使用牛黃，2013年向國家食品藥品監督管理總局備案藥品注冊補充申請，使用人工牛黃代替牛黃投料。處方中的人工牛黃由膽酸、牛膽粉、豬去氧膽酸、膽紅素、牛磺酸、膽固醇、微量元素等加工制成，具有清熱解毒、化痰定驚的作用[1]。膽紅素為人工牛黃的主要成分之一，可在機體中發揮抗氧化、抗凋亡、免疫調節、抗炎等作用[2－3]，是人工牛黃發揮藥效的重要成分。因其在空氣中尤其光照下極易氧化，在提取過程中又易受影響而衰減[4]，故應建立合理、有效的測定方法來控制其膽紅素的含量。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定小兒化毒膠囊人工牛黃中膽紅素的含量，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（含Empower色譜工作站，美國沃特斯公司）；BS224S型及BP211D型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；優普系列超純水器（四川優普超純科技有限公司）；KQ－500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

膽紅素對照品（批號為 100077－200805，純度以98.5%計），購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（批號為 0000170700）、甲醇（批號為 0000170699）均為色譜純，購自北京化標源科技有限公司；冰醋酸（批號為20150804）、三氯甲烷（批號為 20170321）、甲醇（批號為20171027）均為分析純，鹽酸（批號為20140711）為優級純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；小兒化毒膠囊（西安碑林藥業股份有限公司，批號分別為10011，10021，10031，10041，10051，10061，20071，20081）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 －乙腈 －1% 冰醋酸（88 ∶1 ∶2）；檢測波長：452 nm；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。在此色譜條件下，膽紅素可達到基線分離，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

供試品溶液：取本品內容物3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷－甲醇－鹽酸－水（90∶10 ∶0.015 ∶0.3）25 mL，稱定質量，冷水超聲處理（250 W，40 kHz）50 min，再稱定質量，用三氯甲烷－甲醇－鹽酸－水（90 ∶10 ∶0.015 ∶0.3）補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

對照品溶液：取膽紅素對照品4.88 mg，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶，加三氯甲烷適量使溶解，再稀釋至刻度。精密量取5 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加三氯甲烷 －甲醇 －鹽酸 －水（90∶10∶0.015∶0.3）混合溶液至刻度，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：取缺人工牛黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取質量濃度為19.23 μg/mL的膽紅素對照品溶液 1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10.0，15.0 μL，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程 Y＝1 808.047 X－4 734.624，r＝0.999 9(n＝7)。結果表明，膽紅素進樣量在 0.019 23 ～0.288 45 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，每次10 μL，測定峰面積。結果的 RSD為0.16%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：精密吸取供試品溶液 10 μL，按2.1項下色譜條件，分別于制備0，4，8，12 h時進行色譜測定，記錄峰面積。結果的 RSD為2.03%(n＝4)，表明供試品溶液僅在4 h內穩定性良好，故溶液測定需要臨用時新制。

重復性試驗：取同批次樣品6份，每份3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，進樣測定。結果膽紅素含量的RSD為2.30%(n＝6)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：稱取膽紅素對照品6.15 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加溶劑制成質量濃度為60.58 μg/mL 的溶液，作為貯備液；取已知含量的樣品（膽紅素含量為 0.084 mg /g）6 份，各 1.5 g，分別加入貯備液 1，1，1，2，2，2 mL，同法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結果見表1。

表1 膽紅素加樣回收試驗結果(n＝6)

2.4 樣品含量測定

對 8 批樣品(批號分別為 10011，10021，10031，10041，10051，10061，20071，20081)按已確定的試驗方法及色譜條件進行測定，結果每粒樣品中膽紅素的含量分別為22.49，14.04，16.12，13.24，27.09，15.56，26.39，26.16μg。

3 討論

3.1 溶液穩定性

膽紅素見光易分解且不穩定，故溶液制備過程應避光，臨用時新制。在進行溶液的穩定性試驗時，測定了制備液每隔2 h的峰面積響應值，結果顯示，膽紅素峰面積響應值逐漸降低，收集峰面積響應值的 RSD在4 h內為2.0%，8 h內為3.9%，12 h內為 5.3%，測定值在 4 h時降低 3.8%，8 h時降低8.6%，12 h時降低12.3%。故溶液制備好后應在4 h內完成測定。

3.2 提取溶劑

本研究中分別用二氯甲烷、水飽和二氯甲烷、三氯甲烷、三氯甲烷 －甲醇 －鹽酸 －水（90∶10∶0.015 ∶0.3）、二氯甲烷 －甲醇 －10% 草酸（100 ∶10 ∶0.1）5 種溶劑進行提取，結果三氯甲烷－甲醇－鹽酸－水（90∶10 ∶0.015 ∶0.3）作為提取溶液時測定值最高。

3.3 方法優越性

2015年版《中國藥典(一部)》人工牛黃項下膽紅素的測定方法為紫外－可見分光光度法，以三氯甲烷作溶劑提取，提取不完全，且測定時易被空氣氧化，方法專屬性較差，存在一定局限性。薄層色譜掃描法用于人工培植牛黃和天然牛黃中膽紅素的定量分析也有報道，該方法專屬性和重復性均欠佳，不能保證測定結果準確[5－6]。另外，還有研究通過差示分光光度法測定中成藥中膽紅素的含量[7]，以及通過間接光度法和流動注射分光光度法測定人工牛黃中膽紅素的含量[8－9]，此2種方法因顯色及試驗條件局限，均未得到廣泛應用。而HPLC法因其方法簡便、高效，測定結果精確可靠等優點而得到廣泛認可，已成為檢測牛黃及其替代品中膽紅素的首選方法[10－14]。

3.4 方法合理性

人工牛黃藥材由各種原料按照一定比例配置而成，本次試驗中收集到的6批不同產地的人工牛黃中膽紅素含量介于0.607% ～0.784%。有文獻報道，以氯仿－冰醋酸（4∶1）為提取溶劑超聲提取，測得人工牛黃中膽紅素的含量介于 0.71% ～0.78%[15]；以二甲基亞砜超聲提取，測得人工牛黃中膽紅素的含量為0.472%[16]。故各結果基本相符。

3.5 轉移率及含量范圍

2015年版《中國藥典(一部)》要求人工牛黃中膽紅素的含量不得低于0.63%，按此含量及處方量計算，每粒小兒化毒膠囊應含有膽紅素 29.99 μg。批號為2016124的小兒化毒膠囊人工牛黃含量為0.607%，按此含量及處方量計算每粒膠囊含有膽紅素28.89 μg。以其為原料制成的3批樣品的含量分別為每粒26.16，26.39，27.09 μg，按每粒裝量為 0.3 g 計算，轉移率分別為 90.6% ，91.3% ，93.8% 。按 70% 轉移率計算，每粒含量為20.2 μg。參考以上測定結果、生產工藝及批間差異，擬規定小兒化毒顆粒每粒含人工牛黃以膽紅素（C33H36N4O6）計，不得少于 18 μg。

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