谷胱甘肽硫轉移酶M1多態性及HPV16感染與宮頸癌的關系

王　靜　王　濤　宋　潔　韓彥龍　代海兵　鄧代千　卜曉波

(牡丹江醫學院基礎醫學院生物學教研室,黑龍江　牡丹江　157011)

據報道，人乳頭瘤病毒(HPV)感染可顯著提高宮頸癌的發病率，HPV16是我國宮頸癌的主要感染型別〔1〕。患者感染后易患尖銳濕疣，宮頸癌患者中約有60%患有尖銳濕疣〔2〕。谷胱甘肽硫轉移酶(GST)是調節體內細胞代謝的主要Ⅱ相代謝酶，能夠幫助細胞代謝毒素，抵抗損傷。在抗腫瘤藥物治療過程中，GST促進藥物代謝，減少化療藥物對細胞的毒性，使細胞產生耐藥傾向。GST主要包括GSTM1、GSTT1、GSTP1，研究表明這3種轉移酶在人群中存在多態性〔3〕。目前研究最多的是GSTM1，已有研究表明GSTM1純合缺陷型(GSTM1 null)參與肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等的形成和臨床轉歸〔4,5〕，但GSTM1基因型與宮頸癌的發生關系尚未明確，并且GSTM1基因型聯合HPV16與宮頸癌的發病率關系鮮有報道。本研究主要探討GSTM1多態性及HPV16感染與宮頸癌的關系。

1　資料與方法

1.1一般資料見表1。選取2014年6月至2015年6月于牡丹江醫學院附屬紅旗醫院治療的116例宮頸癌患者作為病例組。納入標準：(1)經病理學確診為宮頸癌；(2)均為首次患上宮頸癌；(3)患者已同意公開個人資料和病情，并簽署知情同意書。排除標準：(1)合并其他慢性病如高血壓、糖尿病者；(2)患有其他腫瘤者。另選取醫院同時期診斷為子宮肌瘤的116例患者作為對照組。納入標準：(1)臨床上經B超確診為子宮肌瘤；(2)能理解并獨立完成問卷調查；(3)患者已同意公開個人資料和病情，并簽署知情同意書。排除標準：(1)孕婦及其他癌癥患者；(2)合并其他慢性病如高血壓、糖尿病者。病例組年齡37～71歲，平均(51.34±10.25)歲；對照組年齡39～68歲，平均(49.53±5.75)歲，差異無統計學意義(t=1.173，P=0.224)。兩組民族、婚姻狀況、籍貫、職業比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1　兩組人口學特征比較〔n(%),n=116〕

1牡丹江醫學院附屬紅旗醫院超聲科

1.2標本采集入院治療前空腹采集全血5 ml，以3 000 r/min離心10 min后保留血凝塊，凍存于-80℃；用宮頸刷對宮頸脫落細胞進行采集，將其浸泡在PBS(pH7.0)液中，在12 h內3 000 r/min離心15 min富集細胞，于-80℃環境下保存。

1.3實驗方法HPV的DNA從已富集的細胞中提取，方法采用多重聚合酶鏈反應(Multiplex PCR)和熱啟動技術，在預變性之后再加DNA聚合酶，檢測HPVl6 DNA及其癌基因；人基因組DNA從血凝塊中提取，GSTMl基因多態性的檢測采用多重PCR技術。

1.3.1樣本DNA的提取用TENNS裂解液(20 mmol/L NaCl、10 mmol/L Tris-HCl pH=8.0、10 mmol/L EDTA、0.5%十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解血凝塊，經蛋白酶K(Merck，Germany)處理、55℃過夜孵育、異丙醇沉淀、75%乙醇洗滌，提取DNA。用相同方法從宮頸脫落細胞中提取HPV-DNA。

1.3.2聚合酶鏈式反應(PCR)用PCR儀(Eppendorf)擴增血凝塊中DNA的GSTM1，上游引物，下游引物，獲得片段大小為218 bp，Albumin作為內參基因。PCR方法擴增宮頸脫落細胞DNA中HPV16 E6區，上游引物，下游引物，β-globin作為內參基因。引物均訂購于上海生物工程公司。TaqDNA聚合酶、10倍緩沖液、10 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2均購自Invitrogen。

1.3.3電泳用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，每孔上樣量為10 μl,Marker(Takara，Japan)上樣量為3 μl。50 V電泳40 min，將電泳結果在VILBER CV-A450凝膠成像儀紫外燈下成像。

1.3.4結果判定HPV陽性判定標準如下:取10 μl的PCR擴增產物，按照5∶1(v∶v)與上樣緩沖液均勻混合，取少量混合液置于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml EB)板，電壓50 V，40 min后取出，與標準分子量進行比較，通過凝膠成像儀紫外燈觀察圖片。HPV16 E6的目的基因片段為208 bp，若HPV16 E6基因為陽性則HPV16也判為陽性。GSTM1基因型判定：取10 μl的PCR擴增產物，加入上樣緩沖液2 μl，均勻混合，取少量混合液置于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴化乙啶)，電壓50 V，30 min后取出，與標準分子量進行比較，通過凝膠成像儀紫外燈觀察。GSTM1目的基因片段為219 bp。如有350 bp條帶則可判定PCR擴增成功：有219(480)bp條帶則說明GSTM1基因存在即非空白型(nonull型)，無219(480)bp條帶則為GSTM1基因純合缺失即空白型(null型)。

2　結　果

2.1GSTM1基因多態性與宮頸癌的關系病例組GSTM1 null型占比〔59.48%(69/116)〕顯著高于對照組〔41.38%(48/116);χ2=7.604,P=0.006〕。

2.2HPV16感染與宮頸癌的關系以HPV16 E6區為檢測片段，病例組HPV16陽性率〔65.52%(76/116)〕明顯高于對照組〔27.59%(32/116)；χ2=33.539,P=0.001〕。

2.3GSTM1基因多態性聯合HPV16感染與宮頸癌的關系GSTM1 null型聯合HPV16陽性者宮頸癌的發病率顯著高于僅GSTM1 null型者或僅HPV16陽性者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　兩組GSTM1基因多態性聯合HPV16感染患病率比較〔n(%),n=116〕

與GSTM1 null型且HPV16陰性者比較：1)P<0.05;與GSTM1 nonull型且HPV16陽性者比較：2)P<0.05

3　討　論

長期感染HPV是宮頸癌發生和發展的重要危險因素，宮頸癌患者中約有60%感染HPV。HPV感染中，HPV16和18是高風險型別〔6〕。HPV E6和E7是主要的病毒基因，在病毒合成過程中，這兩個病毒基因表達明顯增高〔7〕。Mattoscio等〔8〕發現HPV E6和E7蛋白選擇性抑制自噬體與溶酶體融合而負向影響自噬過程，降低了腫瘤抑癌基因p53表達下調，引起UBC9上調。UBC9是細胞功能必需的調節因子，它的過表達引起細胞抗凋亡能力增加，進而誘發腫瘤形成。

人類基因存在大量遺傳多態性，多篇文獻報道單個核酸多態性(SNP)導致基因表達缺失，嚴重影響疾病的發生發展〔9，10〕。GST是人類體細胞中不可或缺的酶類，由細胞內一系列催化和非催化蛋白組成。GSTs參與多種腫瘤的發展，涉及細胞毒性物質的生物轉化、內源性活性氧的降解，其SNP位點能夠引起完全或選擇性酶活性缺失，可能導致細胞對環境或氧化壓力的敏感和異變。近期，有文獻報道GSTs通過部分蛋白間相互作用，參與調節細胞增殖和凋亡〔11〕，其中GSTM1的作用最為明顯。而GsTMl基因缺失可導致體內致突變物和致癌物的水平受到影響，其是造成細胞基因突變的主要原因之一，同時HPV通過與宿主細胞整合可導致DNA發生突變，這也是引發宮頸癌的主要因素之一。在體內，GSTs代謝酶可通過正常代謝酶活性阻止體細胞的DNA發生突變，防止HPV和宿主細胞整合，即使HPV和宿主細胞發生整合，也可以對受損DNA的修復產生促進作用。本研究顯示病例組GSTM1 null型占比為59.48%，對照組GSTM1 null型占比為41.38%，且差異有統計學意義(P<0.05)，提示GSTM1純合缺失型與宮頸癌的發病密切相關。同時，病例組HPV16陽性率為65.52%，對照組HPV16陽性率僅為27.59%，差異有統計學意義(P<0.05)，提示HPV16感染可能是宮頸癌發病率的主要危險因素之一。另外，GSTM1 null型且HPV16陰性者宮頸癌患病率為12.93%，HPV16陽性且GSTM1 nonull型宮頸癌患病率為18.97%，而GSTM1 null型且HPV16陽性者宮頸癌患病率高達46.55%，GSTM1 null型聯合HPV16陽性者宮頸癌的發病率顯著高于僅GSTM1 null型者或僅HPV16陽性者，差異有統計學意義(P<0.05),提示GSTM1純合缺失型與 HPV16感染可能存在協同作用，兩者聯合可能大大提高宮頸癌的發生率。HPV16感染細胞后整合到宿主基因組中，GSTM1酶促進斷裂的宿主基因修復，降低HPV16病毒的嵌入。GSTM1純合缺失導致酶活性缺失，基因不能及時修復，增加了HPV16病毒整合到宿主基因的概率。HPV16感染引起的細胞氧化壓力和炎癥反應，需要GSTM1酶的降解和清除，GSTM1純合缺失型導致細胞對HPV16感染產生異變，趨向癌化。因此，GSTM1純合缺失型作為個體化的基因背景，能夠幫助HPV16感染的細胞抗擊炎癥反應而得以存活。

綜上所述，GSTM1純合缺失型與 HPV16感染可能存在協同作用，兩者聯合作用顯著增加了宮頸癌的患病率。因此檢測GSTM1基因型、早期篩查及防治HPV感染，同時也應針對HPV感染等高危人群進行宮頸癌防治知識的宣教，對實現宮頸癌的“三早”預防，降低宮頸癌發病率具有重要意義。

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4張紅艷,吳緒偉,肖誼,等.谷胱甘肽S-轉移酶M1、T1基因多態性及氧化應激與非小細胞肺癌易感性〔J〕.中國醫科大學學報,2014；43(5):432-6.

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7許冬蕾,岑堯,游存厚,等.HPV16-E6蛋白在宮頸病變中的研究進展〔J〕.疾病監測與控制,2016；10(3):204-5.

8Mattoscio D,Casadio C,Miccolo C,etal.Autophagy regulates UBC9 levels during viral mediated tumorigenesis〔J〕.PLoS Pathogens,2017；13(3):e1006262.

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11Hasan S,Hameed A,Saleem S,etal.The association of GSTM1 and GSTT1 polymorphisms with squamous cell carcinoma of cervix in Pakistan〔J〕.Tumour Biol,2015；36(7):5195-9.