跑臺訓練對脊髓損傷大鼠運動功能及Notch信號通路的影響

孫　鵬　袁瓊嘉　趙衛(wèi)衛(wèi)　

(玉林師范學院體育健康學院，廣西　玉林　537000)

1成都體育學院運動醫(yī)學系2德陽市人民醫(yī)院康復科

脊髓損傷(SCI)是一類有極高致殘率和致死率的中樞神經系統(tǒng)疾病，發(fā)病率呈年上升趨勢，由于SCI后復雜的生理病理及神經系統(tǒng)再生的限制，目前仍缺乏有效的治療方式〔1〕。近些年來，隨著對康復醫(yī)學的不斷發(fā)展及對損傷機制的不斷了解，運動訓練成為目前臨床上對SCI治療不可缺少的一部分。運動訓練能促進營養(yǎng)因子的分泌表達、誘導神經肌肉的塑性、改善脊髓局部血液循環(huán)、促進突觸的正確聯(lián)系及軸突的再生，對于損傷后的功能恢復有重要作用〔2，3〕。很多研究采用運動訓練提高SCI的治療效果，由于運動訓練方法、損傷程度、訓練強度、訓練時間等多種因素，目前對各種運動訓練的效果存在一定的爭議。本研究建立SCI大鼠模型采用跑臺訓練對其運動功能進行評分，并探討相關作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物成年雌性健康SD大鼠36只，體重260～300 g，均由廣西醫(yī)科大學動物實驗室提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～24℃，采取自由采食和飲水，并分籠飼養(yǎng)。

1.2主要試劑和儀器熒光定量試劑盒及反轉錄試劑盒購自日本Takala；熒光定量PCR儀購自美國ABI；跑步訓練器為自制。

1.3SCI模型的建立將10%水合氯醛按照300 mg/kg體重腹腔麻醉大鼠，麻醉成功后俯臥位固定于手術臺上，背部剪毛并消毒，以T10棘突為中心做后背部長約3 cm的正中切口，鈍性分離背部的皮下組織，用血管鉗固定，用血管鉗咬除T8椎板和棘突，充分暴露出T9節(jié)段的脊髓，使大鼠脊髓處于水平位。以T9相應的區(qū)域為損傷區(qū)，以正中血管為中心，用一重量為10 g的砝碼沿玻璃導管垂直下落，造成脊髓急性挫傷。模型制作成功的標志為大鼠的下肢回縮性撲動，尾巴痙攣擺動，被打擊的局部脊髓表面迅速出現(xiàn)淤紫色，術后雙肢僵硬，并出現(xiàn)完全癱瘓。之后逐層縫合并皮下注射2 ml生理鹽水，并連續(xù)3 d肌肉注射20萬U青霉素。術后每天上下午各進行一次膀胱按摩協(xié)助排尿，直至形成反射性排尿為止。

1.4實驗分組模型制作過程中共死亡6只，剔除腸脹氣、泌尿系統(tǒng)感染等原因，剩余30只，隨機分為3組：SCI模型組、運動訓練組和正常組(無脊髓損傷也不做訓練)，每組10只。

1.5運動訓練本研究采用跑臺訓練。參照相關文獻〔4，5〕及預實驗的結果，運動訓練在造模成功后的第2天開始，根據(jù)大鼠自身的狀況，跑臺速度設定為6～15 m/min，每天進行30 min訓練，分2次進行，每次訓練15 min，2次間隔5 min，5次/w。訓練過程中如出現(xiàn)大鼠停滯不動時，適當給予陰囊刺激，確保訓練的正常進行。大鼠每次訓練前排空膀胱，訓練后及時給予食物和飲水補充。

1.6運動功能評定分別在損傷前及損傷后的1、7、14、21、28 d對各組大鼠的運動功能進行評定，采用BBB評分法〔6〕和改良Tarlow評分〔7〕兩項。

1.7Notch1、發(fā)狀分裂相關增強子(Hes)1表達的檢測采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法。麻醉處理各組大鼠，手術截取以脊髓損傷部位為中心5 mm長度的脊髓組織，提取組織中的總RNA，逆轉錄試劑盒反轉錄總RNA為cDNA。根據(jù)GenBank基因庫搜索出鼠Notch1、Hes1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)共3個基因的CDS序列，利用Primer premier6.0引物設計軟件設計Notch1、Hes1和GAPDH的RT-PCR引物，每個樣品設置6個重復孔，以cDNA為模板用實時熒光定量PCR儀對Notch1、Hes1和GAPDH基因進行擴增。引物序列如下：Notch1上游引物：5′-CCTTTACCTGCCTCTGCC-3′，下游引物：5′-GTCCTGTGGTCCCCTTGA-3′。Hes1上游引物：5′-GAGGCTGCCAAGGTTTTT-3′，下游引物：5′-GGTGGGCTAGGGAGTTTATG-3′。GAPDH上游引物：5′-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物：5′-GACGCCAGTAGACTCCACGACA-3′。PCR擴增條件為：95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 60 s，72℃ 20 s，以上共40個循環(huán)。72℃延伸15 min，4℃保存。根據(jù)Ct值利用2-△△Ct法計算各基因mRNA相對表達量。

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2　結　果

2.1各組不同時間點BBB評分比較SCI模型組及運動訓練組各時間點BBB評分均顯著低于正常組(均P<0.05)，運動訓練組從14 d起B(yǎng)BB評分均顯著高于SCI模型組(均P<0.05)，見表1。

2.2各組不同時間點改良Tarlow評分比較SCI模型組及運動訓練組在各時間點改良Tarlow評分均顯著低于正常組(均P<0.05)，運動訓練組從14 d起改良Tarlow評分均顯著高于SCI模型組(均P<0.05)，見表2。

表1　各組不同時間點BBB評分結果分)

與正常組比較：1)P<0.05；與SCI模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2　各組不同時間點改良Tarlow評分結果分)

2.3各組不同時間點Notch1、Hes1 mRNA相對表達量比較SCI模型組和運動訓練組各時間點Notch1、Hes1 mRNA相對表達量均顯著高于正常組(均P<0.05)，運動訓練組在各時間點Notch1、Hes1 mRNA相對表達量均顯著低于SCI模型組(均P<0.05)，見表3。

表3　各組不同時間點Notch1、Hes1 mRNA相對表達量

3　討　論

目前對SCI主要的康復治療為中醫(yī)針灸、運動訓練、并發(fā)癥的康復治療、心理干預、物理因子、矯形器及輔助用具應用等。運動訓練是SCI后肢體功能恢復的重要措施。研究發(fā)現(xiàn)，SCI后何時進行運動訓練是有嚴格限制的，基本在損傷后的2 w至2月之間，若訓練開始太晚，會由于有大量的死亡細胞及在局部損傷部位形成的膠紙瘢痕而影響治療效果〔8〕。也有研究發(fā)現(xiàn)，在SCI后開始訓練太早可能會加重組織缺氧、缺血，進一步加重損傷，認為適當?shù)匮悠谥委熓鞘直匾摹?〕。本研究中考慮到SCI后期損傷全身及局部就開始啟動復雜的繼發(fā)性損傷，其嚴重程度直接影響后期的功能恢復情況，且運動能改善局部微環(huán)境，因此，本研究在術后24 h即開始運動訓練。目前對于SCI的運動訓練主要包括主動訓練、被動訓練、電刺激訓練等多種方式。跑臺訓練為一種被動訓練，研究證實其對SCI的功能恢復有一定療效〔10，11〕。

Notch信號通路是在進化上高度保守的細胞途徑，廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，由Notch受體和配體、下游效應物、DNA結合蛋白等組成，參與調節(jié)細胞的增殖、凋亡、分化及機體的發(fā)育等過程。研究顯示，Notch信號通路對于神經干細胞的增殖及分化有重要影響，在SCI后的表達明顯增強〔12，13〕。電針對SCI的治療可能與Notch信號通路有關〔14〕。

綜上，跑臺訓練可顯著降低SCI大鼠的BBB評分法和改良Tarlow評分，并下調Notch1、Hes1的表達，這說明跑臺訓練對脊髓損傷大鼠治療可能通過抑制Notch信號通路起作用。

1Ruschel J，Hellal F，F(xiàn)lynn KC，etal.Systemic administration of epothilone B promotes axon regeneration after spinal cord injury〔J〕.Science，2015；348(6232)：347-52.

2Rank MM，F(xiàn)lynn JR，Battistuzzo CR，etal.Functional changes in deep dorsal horn interneurons following spinal cord injury are enhanced with different durations of exercise training〔J〕.J Physiol，2015；593(1)：331-45.

3Gorman PH，Scott W，York H，etal.Robotically assisted treadmill exercise training for improving peak fitness in chronic motor incomplete spinal cord injury：a randomized controlled trial〔J〕.J Spin Cord Med，2016；39(1)：32-44.

4Cha J，Heng C，Reinkensmeyer DJ，etal.Locomotor ability in spinal rats is dependent on the amount of activity imposed on the hindlimbs during treadmill training〔J〕.J Neurotrauma，2007；24(6)：1000-12.

5Multon S，F(xiàn)ranzen R，Poirrier AL，etal.The effect of treadmill training on motor recovery after a partial spinal cord compression-injury in the adult rat〔J〕.J Neurotrauma，2003；20(8)：699-706.

6Basso DM，Beattie MS，Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats〔J〕.J Neurotrauma，1995；12(1)：1-21.

7Gale K，Kerasidis H，Wrathall JR.Spinal cord contusion in the rat：behavioral analysis of functional neurologic impairment〔J〕.Exp Neurol，1985；88(1)：123-34.

8West CR，Taylor BJ，Campbell IG，etal.Effects of inspiratory muscle training on exercise responses in Paralympic athletes with cervical spinal cord injury〔J〕.Scand J Med Sci Sports，2014；24(5)：764-72.

9Bochkezanian V，Raymond J，De Oliveira CQ，etal.Can combined aerobic and muscle strength training improve aerobic fitness，muscle strength，function and quality of life in people with spinal cord injury? A systematic review〔J〕.Spinal Cord，2015；53(6)：418-31.

10Jung SY，Kim DY，Yune TY，etal.Treadmill exercise reduces spinal cord injury induced apoptosis by activating the PI3K/Akt pathway in rats〔J〕.Exp Ther Med，2014；7(3)：587-93.

11Nees TA，Tappe-Theodor A，Sliwinski C，etal.Early-onset treadmill training reduces mechanical allodynia and modulates calcitonin gene-related peptide fiber density in lamina Ⅲ/Ⅳ in a mouse model of spinal cord contusion injury〔J〕.Pain，2016；157(3)：687-97.

12Chen S，Luo M，Zhao Y，etal.Fasudil stimulates neurite outgrowth and promotes differentiation in c17.2 neural stem cells by modulating notch signalling but not autophagy〔J〕.Cell Physiol Biochem，2015；36(2)：531-41.

13Chen BY，Zheng MH，Chen Y，etal.Myeloid-specific blockade of notch signaling by rbp-j knockout attenuates spinal cord injury accompanied by compromised inflammation response in mice〔J〕.Mol Neurobiol，2015；52(3)：1378-90.

14Geng X，Sun T，Li J，etal.Electroacupuncture in the repair of spinal cord injury：inhibiting the Notch signaling pathway and promoting neural stem cell proliferation〔J〕.Neural Regen Res，2015；10(3)：394-403.