唑來膦酸對乳腺癌小鼠的抑瘤作用

楊　超　李　林　郭慶軍　劉運江　

(河北醫科大學第四醫院乳腺中心，河北　石家莊　050011)

1石家莊市人民醫院乳腺科2河北醫科大學教務處

乳腺癌致死原因主要為復發及轉移。采用化療輔助治療乳腺癌可將亞臨床微小轉移灶有效殺滅，減少復發率、死亡率，乳腺癌骨轉移發生率亦較高，而對于骨轉移的治療主要有介入、藥物治療或放療。唑來膦酸是目前治療骨轉移比較常用的藥物，效果顯著。有研究表明，唑來膦酸同時具有抗骨轉移和抗腫瘤效果〔1〕。本研究對4T1皮下移植瘤小鼠給予唑來膦酸聯合多西他賽治療，觀察其抑制腫瘤療效。

1　材料和方法

1.1材料4T1鼠系乳腺癌細胞株、多西他賽注射液(國藥準字H20052068，深圳萬樂藥業)；注射用唑來膦酸(注冊證號 H20140218，Novartis Pharma Schweiz AG)；IRDye 800CW EGF探針(美國LICOR公司)。

1.2試驗方法選取對數生長期4T1細胞混懸液，將其在BALB/c小鼠右腋乳墊區進行接種，單只腫瘤細胞混懸液劑量為0.1 ml(1×106個)。1 w后可觸及皮下腫瘤時證明已完成小鼠腫瘤模型種植，腫瘤體積為150～200 mm3時將其隨機分組。隨機將32只小鼠隨機平分為A、B、C、D組，其中A組作為對照，于小鼠腹腔注射0.2 ml生理鹽水；B組采用唑來膦酸注射，與每只小鼠皮下注射5 μg唑來膦酸；C組采用多西他賽注射，每只小鼠腹腔注射15 mg/kg多西他賽；D組采用唑來膦酸和多西他賽聯合注射，首先腹腔注射15 mg/kg多西他賽，然后在同一只小鼠皮下注射5 μg唑來膦酸，以上4組均每周注射2次，共3 w。

1.3觀察指標

1.3.1小鼠腫瘤重量、抑瘤率的測定計算腫瘤形成時，每3 d采用電子天平測量單只鼠重量，將小鼠處死后徹底剝離瘤體，然后稱腫瘤重量和抑瘤率。B、C、D組抑瘤率分別為(A組腫瘤平均值-本組腫瘤重量平均值)/A組腫瘤平均值×100%。唑來膦酸和多西他賽聯合用藥對4T1乳腺癌細胞株抑制效果評估根據金正均Q值法〔8〕，即Q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中Ea為唑來膦酸對腫瘤抑制率，Eb為多西他賽對腫瘤抑制率，E(a+b)聯合用藥對腫瘤抑制率。當0.851.15時藥物聯合為協同效果，Q<0.85時藥物聯合為拮抗效果。

1.3.2小鼠活體移植瘤熒光成像注射藥物后1 d，將EGF探針通過小鼠尾靜脈進行注入，然后對小鼠體內腫瘤細胞進行標記，在下肢肌肉通過選用氯胺酮注射麻醉小鼠，起效且滿意后把小鼠放入成像儀內并固定，在成功標記后的10 min、24 h、48 h、72 h進行成像，然后對小鼠進行瘤體、臟器解剖。

1.3.3瘤體細胞凋亡率測定取解剖后流體邊緣新鮮組織，將其置于70%酒精內24 h，然后將其取出并制作成單細胞懸液，通過應用流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。

1.3.4小鼠轉移灶計數及臟器組織病理觀察對小鼠的臟器和瘤體進行解剖，若觀察發現有肺臟轉移病灶時先行生理鹽水清洗，然后在顯微鏡下記錄肺臟表面轉移灶數量，將瘤體和除肺臟以外的其他臟器放入10%中性甲醛溶液中，制成石蠟塊。石蠟切片，HE染色肝、肺臟、脊柱和腫瘤，顯微鏡觀察其組織病理狀態。

1.4統計學方法采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD檢驗。

2　結　果

2.1各組腫瘤體積、腫瘤重量及抑瘤率比較4組荷瘤小鼠經處理后腫瘤體積增大緩慢，D組及C組腫瘤體積顯著小于A組(P<0.05)、B組腫瘤體積略小于A組，但差異無統計學意義(P>0.05)，D組腫瘤體積明顯小于C組(P=0.011)，見表1。將小鼠處死并剝離完整腫瘤進行重量測定，B、C、D組抑制瘤率的Q值均>1.15。B組與A組腫瘤重量差異無統計學意義(P>0.05)；C組、D組腫瘤重量明顯小于B組，D組明顯小于C組(P<0.05)，C組(26.5%)、D組(34.9%)抑瘤率明顯大于A組(5.2%，P<0.05)，D組抑瘤率明顯大于C組(P<0.05)，按照Q值>1.15可判定D組聯合用藥具有顯著協同作用。

表1　各組腫瘤體積、腫瘤重量比較

與A組比較：1)P<0.05，與B組比較：2)P<0.05，與C組比較：3)P<0.05

2.2各組活體移植瘤熒光成像C組、D組的腫瘤熒光密度平均值(3.12±0.28，2.11±0.23)明顯小于A組(6.61±0.22，P<0.05)，B組腫瘤熒光密度平均值(6.32±0.39)略小于A組，但差異無統計學意義(P>0.05)，D組腫瘤熒光密度平均值顯著小于C組(P<0.05)，見圖1。

2.3各組移植瘤細胞凋亡率及肺臟轉移灶數量比較D組細胞凋亡率〔(19.15±0.87)%〕顯著高于A、B、C組〔(10.38±0.74)%、(11.21±0.45)%、(13.23±0.62)%，P<0.05〕；B組、C組細胞凋亡率略高于A組，但差異無統計學意義(P>0.05)。C組、D組轉移灶數量(17.13，7.38)顯著小于A組、B組(40.38，36.12，P<0.05)。B組與A組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4各組臟器組織病理學觀察解剖小鼠后可見雙肺轉移，未發現腹腔腹水及肝、骨轉移。HE染色光鏡可見A組癌巢境界清晰，腫瘤細胞呈條、索狀，細胞核異型明顯；B組、C組、D組可見略增大的腫瘤細胞，少數細胞出現固縮、裂解，最終演變為凋亡、壞死的細胞。腫瘤內可見大量炎性細胞浸潤和壞死組織，纖維化明顯，表明腫瘤生長受抑制，見圖2。

圖1　各組活體移植瘤熒光成像

圖2　各組臟器組織病理學觀察

3　討　論

唑來膦酸對腫瘤引發的骨轉移具有顯著的治療效果，有資料表明，唑來膦酸較2代雙膦酸鹽藥物比較具有起效快、緩解率高、持續緩解時間長等優點〔2〕。本研究顯示，唑來膦酸對代謝性骨病具有明顯的治療效果，其抗腫瘤作用顯著，其可在微摩爾濃度下對RhoA進行抑制、使趨化因子受體有所下調、抑制基質金屬蛋白酶(MMPs)的侵襲作用〔3〕。唑來膦酸可能通過對MDC1基因mRNA表達進行下調，破壞DNA修復機制，引發細胞凋亡而產生抑瘤效果〔4〕。唑來膦酸可“靶向”作用于骨骼系統，其可首先與骨表面相結合，而對除骨系統以外的軟組織腫瘤抗腫瘤能力較低。本研究顯示多西他賽和唑來膦酸聯合應用具有更為突出的腫瘤抑制作用；與相關臨床研究結果相符〔5，6〕。

輔助化療可將乳腺癌患者體內無法臨床識別的微小轉移灶及殘余病灶進行有效消滅。并且對內臟轉移的阻止具有一定的作用。本研究證明多西他賽聯合唑來膦酸具有較好的抗腫瘤療效，對腫瘤細胞的侵襲具有較好的降低或滅活作用，乳腺癌轉移過程有所減慢，使小鼠生存無進展期得到延長。

1Clezardin P，Fournier P，Boissier S，etal.In vitro and in vivo antitumor effects of bisphosphonates〔J〕.Curr Med Chem，2003;10：173-80.

2Witters L，Javeed M，Cfispino J，etal.Inhibiton of growth human breast cancer cell lines with the combination of zoledronic acid and a COX-2 inhibitor〔J〕.Eur J Cancer，2001;37(6)：78.

3Marra M.Abbruzzese A，Addeo R，etal.Cutting the limits of aminobisphosphonates：new strategies for the potentiation of their antitumour effects〔J〕.Curr Cancer Drug Targets，2009；9：791-800.

4茆勇，馬鳳錦，黃朝暉，等.順鉑聯合唑來膦酸對肺癌A549細胞增值的影響及其機制〔J〕.中華實驗外科雜志，2011；28(11)：1939-40.

5Witters LM，Crispino J，Fraterrigo T，etal.Lipton，effect of the combination of docetaxel，zoledronic acid and a COX-2 inhibitor on the growth of human breast cancer cells〔J〕.Am J Clin Oncol,2003;26(1)：92-7.

6Hiraga T，Ueda A，Tamura D,etal.Effects of oral UFT combined with or without zoledronic acid on bone metastasis in the 4T1/luc mouse breast cancer〔J〕.Int J Cancer,2003;106(6)：973-9.