循環纖維細胞在慢性哮喘模型小鼠氣道重塑中的作用

任冬花　關　巍　馮喜英　李西玲　趙　立

(西寧市第二人民醫院呼吸科,青海　西寧　810003)

1青海大學附屬醫院呼吸科

2中國醫科大學附屬盛京醫院第一呼吸與重癥監護內科病房

哮喘以氣道高反應性、可逆性氣流受限和慢性氣道炎癥為特點〔1〕循環纖維細胞隨著其來源、表型轉化的特點和在組織損傷修復過程中的作用得到認可，學者們對其研究越來越多〔2～4〕。本文探討循環纖維細胞在哮喘氣道重塑中的作用。

1　材料與方法

1.1材料SPF級健康雌性BALB/c 小鼠30 只，6 周齡，體重(20±3)g，由中國醫科大學實驗動物中心提供(合格證編號4200592945)。將其隨機編號并分為：對照組、哮喘組和氯化釓清空組，每組10只。室內溫度18℃～25℃，濕度45%～55%，飼料和應用水均經充分消毒，保證充足食物和水分供應。每日觀察小鼠生存狀態，及時更換敷料和鼠籠，保證其生存環境衛生。卵原蛋白(OVA)、氯化釓、戊巴比妥鈉：美國Sigma 公司；氫氧化鋁：上海金賽醫藥化工有限公司；大鼠抗小鼠CD45 單克隆抗體：美國Biolegend 公司；免疫酶標雙標試劑盒購：福州邁新生物技術開發有限公司；多聚賴氨酸：金賽醫藥化工有限公司；兔抗小鼠Ⅰ型膠原單克隆抗體、兔抗小鼠α-平滑肌肌動蛋白(SMA)單克隆抗體：武漢博士德生物工程有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2實驗方法第1、8、15天哮喘組和氯化釓清空組小鼠腹腔內注射氫氧化鋁(2 mg)和OVA(20 μg)混懸液，對照組以等量磷酸鹽緩沖液(PBS)代替。第21天開始，哮喘組和氯化釓清空組給予50 mg/kg 戊巴比妥麻醉后，經滴鼻吸入0.2%OVA激發小鼠，50 μl/只，每周3次，持續至第52天，共計13次，對照組等量PBS 等時間間隔滴鼻吸入。每次激發前10 min，氯化釓清空組經尾靜脈給予氯化釓(2 mg/ml，10 mg/kg，每隔2 d 1次)，對照組和哮喘組用等量的PBS代替，給予時間和方式與氯化釓清空組相同。通過HE染色觀察組織形態學變化及圖像分析；通過Masson染色觀察膠原沉積；通過免疫酶標雙標染色法觀察氣道纖維細胞表面表達。

1.3主要觀察指標HE染色觀察組織形態學變化及圖像分析 將肺組織標本切片置于光學顯微鏡下，先于100倍下找到視野，后放大到400倍下仔細觀察各組小鼠支氣管肺組織的基底膜、平滑肌厚度變化及嗜酸性粒細胞浸潤和上皮細胞、杯狀細胞的改變情況。并在400倍下找到完整的支氣管橫斷面，用HIMAS-2000圖像分析軟件測量支氣管基底膜周徑(Pbm)、基底膜面積(Bm)和平滑肌面積(Wam)。Masson 染色觀察膠原沉積：光學顯微鏡下觀察并比較各組切片組織中膠原變化情況。參照文獻〔5〕，以固定顏色模式界定膠原，色調、飽和度、顏色強度等條件下測定氣道壁膠原面積(WAc)，結果以單位長度基底膜的膠原面積(WAc/Pbm，μm2/μm)表示。免疫酶標雙標染色法觀察氣道纖維細胞表面表達：將Ⅰ型膠原和α-SMA表達陽性的細胞質經即用型堿性磷酸酶染色液(BCIP/NBT)染色(陽性顯色為藍黑色)，CD45表達陽性的細胞質經AEC 染色(陽性染色為紅色)。染色后的組織切片置于光學顯微鏡下，先于低倍鏡下找到視野，放大到高倍鏡后，觀察比較CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原的表達狀況。

1.4統計學方法采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析、t檢驗，兩個變量間的關系采用線性相關分析。

2　結　果

2.1各組小鼠一般情況表現哮喘組小鼠經致敏和激發兩階段后，出現了不同程度的煩躁不安、易激惹、呼吸急促、喘息等癥狀；對照組小鼠行動敏捷，未見異常；氯化釓清空組上述表現較哮喘組明顯減輕。

2.2各組支氣管肺組織病理改變及形態學觀察見圖1 和表1，哮喘組基底膜、平滑肌層厚度較對照組顯著增厚(P<0.05)，氯化釓清空組較哮喘組基底膜、平滑肌厚度顯著降低(P<0.05)。

圖1　各組肺組織病理學變化(HE，×400)

組別基底膜厚度平滑肌厚度對照組219±0391)617±0691)哮喘組890±0532305±074氯化釓清空組372±0321)886±0541)P值001001

與哮喘組比較：1)P<0.05

2.3各組氣道膠原沉積狀況見圖2，表2，各組Masson染色的結果顯示，對照組氣道和血管周圍少量的膠原沉積或不表達；哮喘組可見氣道和血管周圍大量的膠原沉積，其中以氣道的基底膜為主，肺泡間隔也可見膠原沉積，較對照組明顯增多；氯化釓清空組可見氣道和血管周圍有膠原沉積，肺泡間隔也可見膠原沉積均較對照組增多；但氯化釓清空組的膠原表達量均比哮喘組減少。HIMAS-2000 圖像分析結果顯示：與對照組〔(6.03±0.17)μm2/μm〕比較，哮喘組〔(31.74±2.08)μm2/μm〕和氯化釓清空組〔(16.02±0.92)μm2/μm〕的膠原表達量明顯增加(均P<0.05)；氯化釓清空組的膠原表達量較哮喘組減少，但仍多于對照組(均P<0.05)。

圖2　各組肺組織膠原沉積(Masson,×400)

2.4各組氣道CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原的表達見圖3和圖4，與對照組氣道CD45、Ⅰ型膠原和α-SMA的表達相比，哮喘組和氯化釓清空組的表達明顯增加(P<0.01)；其中哮喘組比氯化釓清空組表達增加(均P<0.05)，見表2。

圖3　各組氣道CD45 和Ⅰ型膠原表達(免疫組化，×400)

圖4　各組氣道CD45和α-SMA表達(免疫組化，×400)

組別CD45+Ⅰ型膠原CD45+α?SMA對照組01372±0033501177±00171哮喘組02290±003221)02273±002361)氯化釓清空組01498±002131)2)01366±001501)2)

與對照組比較：1)P<0.01;與哮喘組比較：2)P<0.05

2.5小鼠氣道CD45、α-SMA和Ⅰ型膠原表達水平與基底膜厚度的相關性哮喘組氣道組織CD45和Ⅰ型膠原表達與基底膜厚度呈正相關(r=0.86，P<0.01)；CD45和α-SMA表達呈正相關(r=0.95，P<0.01)。氯化釓清空組氣道組織CD45和Ⅰ型膠原表達與基底膜厚度呈相關(r=0.96，P<0.01)，氯化釓清空組氣道組織CD45和α-SMA表達與基底膜厚度呈正相關(r=0.89，P<0.01)。

3　討　論

氣道重塑的發生機制尚未明確，研究發現哮喘患者支氣管上皮下纖維細胞數量較正常人增多，并與支氣管基底膜的增厚相關〔6，7〕。本實驗發現，哮喘小鼠氣道CD45高水平表達，表明氣道表達CD45 的細胞可能來源于循環纖維細胞。同樣，哮喘小鼠氣道Ⅰ型膠原的表達增高和氣道中膠原沉積量顯著增加，這一方面說明膠原的沉積在氣道重塑中起著至關重要的作用；另一方面表明纖維細胞具有相當活躍的生成膠原的能力，提示慢性哮喘氣道重塑可能與氣道纖維細胞水平有關，與Nihlberg等〔8〕的實驗結果一致，相比正常受試者，輕度哮喘患者支氣管黏膜及肺泡灌洗液中共同表達CD45、Ⅰ型膠原和α-SMA 的纖維細胞數量增加，這些細胞多聚集在鄰近基底膜部位，且黏膜下纖維細胞的數量與基底膜的厚度呈正相關。

氯化釓是循環纖維細胞前體即單核細胞的特異性抑制劑，通過特異性誘導外周血單核細胞的凋亡來特異性抑制其分化〔9,10〕。本實驗結果表明運用氯化釓清空循環纖維細胞后，氣道重塑得到顯著抑制，提示循環纖維細胞在慢性哮喘氣道重塑中起著重要的作用〔11,12〕。

然而，本次實驗并未提供直接的證據表明，哮喘小鼠支氣管黏膜中的纖維細胞是從循環中招募而來的纖維細胞，即氣道中的纖維細胞也有可能是來自于氣道中固有的未經確認的前體細胞。在分化過程中是否存在中間過渡的細胞亞型如前肌成纖維細胞；循環纖維細胞是直接分化為肌成纖維細胞，還是它刺激了組織中固有間質細胞或者其他前體細胞的增殖分化，這些仍需進一步研究。

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3劉海燕.纖維細胞與支氣管哮喘呼吸道重構〔J〕.醫學綜述，2012；18(18)：2970-2.

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8Nihlberg K，Larsen K,Hultgardnnilsso A,etal.Tissue fibrocytes in patients with mild asthma：a possible link to thickness of reticular basement membrane〔J〕? Respir Res，2006；7(1)：1-9.

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