鐵皮石槲對D-半乳糖致阿爾茨海默病模型小鼠大腦病理的影響

農　嵩　凌霄雁　韋愛伯　鄧曉珍　黃炳臣　潘　霖　張子麗　張樹球

(右江民族醫學院生物化學教研室，廣西　百色　533000)

1右江民族醫學院附屬醫院

鐵皮石槲是蘭科石槲屬多年生附生草本植物，主要分布我國西南和江南各省〔1〕，性氣平、味甘、淡、歸胃腎經，具有益胃生津，滋陰清熱的功效。臨床可用于慢性胃炎、高血壓、糖尿病等癥，還具有抗腫瘤、抗衰老等作用。阿爾茨海默病(AD)是老年人常見的疾病，以認知能力迅速減退為特征，實際是快速衰老。本實驗利用D-半乳糖加亞硝酸鈉給小鼠腹腔注射，建立衰老模型〔2〕；用鐵皮石槲提取液灌胃治療，測定大腦乙酰膽堿酯酶(AchE)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)等指標，同時取大腦行病理檢查，觀察其抗衰老作用。

1　材料與方法

1.1試劑D-半乳糖、亞硝酸鈉、氯化鈉、冰醋酸(分析純，Sigma產品)；AchE、GSH-Px、MDA分別購自四川成都邁克科技有限公司、凱基生物公司、南京建成生物工程研究所。

1.2中藥鐵皮石槲(干藥材)由廣西玉林師范學院惠贈。藥物稱量，放提取鍋內，加水，加熱提取：提取藥液→加乙醇沉淀→過濾去沉淀→回收乙醇→藥液定容，分裝密封，高壓105℃滅菌30 min，取出冷卻放冰箱保存。首烏復方(制首烏，龍眼肉等)提取液和金銀花復方口服液(金銀花，甘草，茯苓等)，制藥方法與鐵皮石槲相同。

1.3動物小白鼠65只，昆明種，3月齡，健康，雌雄各半，購自右江民族醫學院動物室，動物實驗許可證：SYXK桂2011-0010，動物生產許可證：SCXK桂2012-0003，購自右江民族醫學院動物室標準動物飼料喂養，稱體重，分籠喂養，每籠3～5只，編號，雌雄分開，自由飲用自來水，放獨立式鼠籠飼養箱內飼養(廣東珠海市再鑫儀器有限公司產品)，空氣過濾凈化，室溫空調26℃～28℃。

1.4AD模型建立用1.2%D-半乳糖和1.8%亞硝酸鈉水溶二液混合給小鼠腹腔注射〔2〕，1次/d，D半乳糖用生理鹽水溶解為1.2%，劑量按120 mg·kg-1·d-1，1.8%亞硝酸鈉，劑量按180 mg·kg-1·d-1，實驗連續60 d。

1.5動物實驗將造模動物分成：鐵皮石槲組、首烏復方組、金銀花組、模型組，另設正常組，各組13只。鐵皮石槲組用鐵皮石槲提取液灌胃，劑量按成人(50 kg體重)劑量(10 ml/次，3次/d)折算，以蒸餾水稀釋成0.4 ml灌胃，從造模后第25天開始，1次/d；首烏復方組用首烏復方提取液灌胃，劑量方法同前折算；金銀花組用金銀花復方口服液灌胃，劑量同前折算；正常組用等量生理鹽水灌胃；至結束前1 w停藥〔3〕。實驗期間正常組1只死亡；模型組3只死亡；鐵皮石槲組2只死亡；首烏復方組2只死亡；金銀花組3只死亡。

1.6生化指標測定實驗結束，從小鼠眼球后靜脈取血0.8～1.0 ml，離心取血清待用。處死動物，取大腦，用生理鹽水洗去血液，并用濾紙吸干水分，稱重，在冰浴下用勻漿器勻漿，用生理鹽水稀釋成10%勻漿，離心(3 500 r/min)10 min，取上清液4℃冰箱保存備用。測定腦勻漿AchE活力、MDA含量、GSH-Px活力〔4〕，具體操作按試劑盒說明書。

1.7大腦病理切片檢查采用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察雌鼠腦組織病理，放大倍數200或400倍。

1.8統計學方法采用SPSS13.0軟件進行方差分析、LSD檢驗。

2　結　果

2.1腦勻漿生化指標和蛋白質水平腦AchE：正常組明顯低于鐵皮石槲組、模型組；GSH-Px：模型組明顯低于其他組；MDA：正常組、首烏復方組明顯低于其他組(P<0.05,P<0.01)；蛋白質含量：各組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2大腦海馬、皮質病理檢查結果見圖1、圖2。正常組：大腦皮質及海馬區神經細胞、神經膠質細胞無變性、壞死，組織結構及層次未見顯著改變。模型組：大腦皮質和皮質海馬區少數神經細胞胞體腫脹、胞質空亮、Nissl體消失、胞核縮小偏位深染，呈急性神經細胞潰變改變，少數神經細胞胞核、胞體收縮，核仁不明顯、核與胞質融合固縮，呈慢性進行性神經細胞壞死改變。鐵皮石槲組病變程度與模型組基本一致。首烏復方組病變程度比鐵皮石槲組輕。金銀花病變程度比模型組和鐵皮石槲組輕。

表1　各組腦勻漿生化指標和蛋白質含量比較

與正常組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01；與首烏復方組比較：4)P<0.05

圖1　各組大腦海馬病理切片檢查(HE)

圖2　各組大腦皮質病理切片檢查(HE)

3　討　論

AD病理特征主要表現在大腦神經系統，如出現老年斑、神經纖維變性纏結、細胞變性凋亡等，而病變主要分布在大腦海馬和皮質部位〔5〕。 海馬神經細胞是膽堿能神經中樞分布的部位，醫學界大多認為膽堿能神經與記憶功能有關，乙酰膽堿是膽堿能神經的神經遞質〔6〕，它以膽堿和乙酰輔酶A為原料，在膽堿乙酰基轉移酶(ChAT)催化下合成，在完成了神經傳導功能之后，又在AchE催化下分解成乙酸和膽堿，正常情況下合成與分解保持著平衡，以維持乙酰膽堿的正常功能，一旦平衡被打破，膽堿能神經功能就會發生障礙，導致認知能力的改變。本實驗結果表明，AD鼠AchE活力明顯升高，經治療有一定降低好轉，接近正常，但鐵皮石槲治療未見降低好轉，接近AD模型；GSH-Px AD模型明顯低于治療組和正常組，說明經治療抗氧化能力明顯增強；MDA含量，首烏復方組和正常組明顯低于其他組，含量最高是模型組，說明其不飽和脂肪酸被氧化分解最強，抗衰老抗氧化能力最差，首烏復方組和正常組抗衰老抗氧化能力最強。

本實驗細胞形態學的改變與生化酶學的變化基本一致，鐵皮石槲未見明顯療效是否因治療時間過短或其他原因，有待進一步研究。

1黃志海，黃結麗.HPLC測定石槲夜光顆粒中小檗堿含量〔J〕.中國中藥雜志，2005；30(14)：1130.

2何勝，玉瑩，陳菊芳，等.用D-半乳糖加亞硝酸鈉建立癡呆癥小鼠模型和中藥治療的效果〔J〕.中國老年學雜志，2014；34(2)：422-4.

3張樹球，黃秋艷，李朝敢，等.用Y型水迷宮測定鋅與海爾福口服液對鉛染毒所致小鼠記憶障礙的改善作用〔J〕.中國冶金工業醫學雜志，2006；23(5)：546-8.

4葉應嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規程〔M〕.第2版.南京：東南大學出版社，1997：2.

5張寶第，郭雄.鋁致阿爾茨海默病的分子機制〔J〕.國外醫學地理分冊，2003；24(1)：57-9.

6官斌，李玉梅，馬駿，等.不同工藝制品的補腎中藥對癡呆小鼠乙酰膽堿酯酶活性和M-受體功能的影響〔J〕.標記免疫分析與臨床，1997；4(3)：152-6.