內皮祖細胞移植對老年輕度認知功能障礙大鼠學習記憶功能的影響

程　琳　張培華　張　韡　

(南陽理工學院張仲景國醫(yī)國藥學院，河南　南陽　473004)

內皮祖細胞(EPCs)具有促進血管新生的功能〔1,2〕。近年EPCs移植術在治療血管相關性疾病一直是研究的熱點〔3〕。老年癡呆是目前全世界都普遍存在的醫(yī)學難題，目前尚沒有理想的治療手段〔4,5〕。而輕度認知功能障礙(MCI)正是介于正常老化和癡呆之間，病患表現(xiàn)出輕度記憶或其他認知功能損害但不影響日常生活能力的一種亞臨床狀態(tài)，是一種可干預的癡呆前狀態(tài)，也是預防性干預的最佳階段。本研究探討EPCs移植對MCI大鼠學習記憶功能的影響。

1　材料與方法

1.1材料140～160 g雄性SD大鼠購自華阜康實驗動物中心；α-MEM、L-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；實驗過程中使用的單抗均購自美國Santa Cruz公司，其他試劑均為市售分析純。

1.2EPCs分離培養(yǎng)采用脫頸椎方法處死大鼠后迅速將大鼠浸泡在75%乙醇中消毒10 min，超凈臺中解剖大鼠，去除大鼠腿部肌肉后分離出股骨和脛骨后使用α-MEM培養(yǎng)液沖洗3次后減去股骺端，使用5 ml注射器吸取標準培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，兩端各沖洗3次后收集細胞懸液至于1 000 r/min離心10 min后棄去上清液和脂肪層后制備單細胞懸液，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中。24 h后棄去非貼壁細胞，全量更換培養(yǎng)液后每48 h更換1次培養(yǎng)液直至細胞生長至80%～90%融合度后按照1∶2的比例進行傳代，傳至第3代后棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入含有20 ng/ml的血管內皮生長因子(VEGF)和20 ng/ml的成纖維細胞生長因子(bFGF)后繼續(xù)培養(yǎng)并隔日更換1次培養(yǎng)液，直至大部分細胞呈片狀，棒狀細胞伴有短突起，多數(shù)細胞呈紡錘形后得到EPCs。

1.3老年MCI大鼠篩選選取30周齡以上大鼠至Y-迷宮中，適應3 min后給予電擊(電流強度0.7 mA，電壓50 V，電擊延時5 s)，選擇對3臂均探索進入的大鼠，淘汰反應過于遲鈍或特別敏感的大鼠，后將篩選得到的大鼠進行學習訓練。將得到的大鼠隨機分為模型組、EPCs組，選取8～10周齡的大鼠作為正常組。

1.4方法將分離培養(yǎng)得到的細胞經消化計數(shù)后使用磷酸鹽緩沖液(PBS)調整到4×106個/ml，將移植組大鼠使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后使用尾靜脈注射0.5 ml EPCs懸液，模型組大鼠采用相同操作，且注射0.5 ml PBS。通過Morris水迷宮法在注射EPCs前、注射后1 d、7 d、14 d和28 d進行行為學測定，包括定位航行實驗和空間探索實驗。各組在完成注射后28 d麻醉。迅速摘取大鼠腦部，并置于液氮中備用。測定腦組織三磷酸腺苷(ATP)酶活力、丙二醛(MDA)、白細胞介素(IL-6)和超氧化物歧化酶(SOD)含量；并通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒測定腦組織中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、環(huán)鳥苷酸(cGMP)和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。

1.5統(tǒng)計學方法采用SPSS15.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2　結　果

2.1各組平均潛伏期比較在第0天時，模型組和移植組平均潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，正常組與模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明大鼠處于認知障礙狀態(tài)。隨著訓練時間的延長，各組大鼠平均潛伏期均顯著低于第0天(P<0.05)，而與模型組相比，移植組在第1天、第7天、第14天及第28天數(shù)據(jù)均顯著降低(P<0.05)，見表1。

2.2各組腦組織相關炎癥因子比較模型組腦組織MDA和TNF-α顯著高于正常組(P<0.05)；移植組與模型組相比，腦組織MDA和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。與正常組相比，模型組SOD和IL-6水平顯著降低，而EPCs移植后SOD和IL-6水平顯著提高(P<0.05)，見表2。

2.3各組腦組織ATP酶活力、NO、NOS和cGMP含量比較模型組NO、NOS和cGMP含量顯著高于正常組(P<0.05)，與模型組相比，移植組NO、NOS和cGMP含量顯著降低(P<0.05)。模型組腦組織ATP酶活力顯著低于正常組，而移植組腦組織ATP酶活力顯著高于模型組(P<0.05)，見表2。

表1　各組平均潛伏期比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05；與本組第0天比較：3)P<0.05，下表同

表2　各組腦組織炎癥因子、ATP酶活力、NO、NOS、cGMP含量比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3　討　論

正常的血液循環(huán)是維持機體組織、細胞保持正常生理功能的基本條件。而隨著年齡的增加，腦部血流量不足會導致組織局部缺血，導致局部組織能量代謝障礙、活性氧增多，導致局部炎癥反應發(fā)生，最后炎癥反應介導的細胞損傷和細胞凋亡導致組織損傷，進而引起認知功能障礙〔6,7〕。而增加腦部供血不足區(qū)域的缺血，可以減少細胞損傷和細胞凋亡，增加腦部修復能力，但是由于缺乏對已經受損的神經元修復和突觸間功能的恢復，這類治療方法目前仍沒有取得滿意的療效。基于這樣的目的，目前依托于干細胞技術的不斷發(fā)展，通過從具有較強分化能力的干細胞中獲得更好的治療方法是目前研究熱點。骨髓基質干細胞是目前研究最為熱門的干細胞，由于獲取方便且分化能力強可在體位大量擴增〔8〕。通過在骨髓間充質干細胞(BMSCs)培養(yǎng)過程中添加神經營養(yǎng)因子和血管生長因子可以使得骨髓間充質干細胞向EPCs定向分化。本研究提示在移植EPCs后大鼠的學習記憶能力顯著提高，腦組織炎癥水平顯著下降。腦部的炎癥會導致腦部神經損傷甚至于學習記憶能力相關的神經元凋亡，降低腦部炎癥水平有助于恢復學習記憶能力。NO是哺乳動物體內普遍存在的一種強生物活性物質，由NOS催化生成，NO在體內有著廣泛的生物學效應，其主要是通過下游cGMP產生作用，與相關研究〔9,10〕本研究顯示，EPCs可能通過提高腦組織ATP酶的活力，從而降低腦組織細胞中線粒體損傷，減輕大鼠缺血再灌注損傷。

1楊亞榮,曾秋棠,郎明健,等.內皮祖細胞移植對大鼠心肌梗死后缺血心肌血管再生及心功能的影響〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2008;12(25):4815-8.

2孔朝紅,劉煜敏,朱江，等.自體骨髓來源內皮祖細胞移植改善腦缺血再灌注大鼠神經功能轉歸〔J〕.國際腦血管病雜志,2012;20(4):257-62.

3姜坤,李傳勇,孟慶友，等.內皮祖細胞移植治療慢性深靜脈血栓形成的實驗研究〔J〕.中華普通外科雜志,2010;25(1):61-4.

4毛梅,張波,傅祖紅,等.內皮祖細胞移植對肺損傷炎癥狀態(tài)的影響〔J〕.中國組織工程研究,2013；17(10):1780-4.

5肖方毅,張懷勤,蔡雪黎,等.自體內皮祖細胞移植修復兔動脈內皮損傷〔J〕.中國動脈硬化雜志,2007;15(10):738-42.

6王寧,王護國,姜濤,等.基質細胞衍生因子1α預處理內皮祖細胞移植治療糖尿病下肢缺血〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復,2011;15(36):6749-52.

7元榮榮,朱麗萍,李丹丹,等.骨髓內皮祖細胞移植治療糖尿病大鼠周圍神經病變的療效觀察〔J〕.中華內分泌代謝雜志,2015;31(11):982-7.

8于萍,李強,劉穎,等.內皮祖細胞移植對糖尿病兔下肢缺血的病理及血管內皮生長因子的影響〔J〕.中國實用內科雜志,2007;27(15):1207-9.

9張京臣,謝慧,湯魯明,等.內皮祖細胞移植對油酸誘發(fā)兔急性肺損傷時炎性反應的影響〔J〕.中華麻醉學雜志,2014;34(5):627-30.

10徐明國,陶軍,王潔梅,等.內皮祖細胞移植修復大鼠頸總動脈內皮損傷〔J〕.中山大學學報(醫(yī)學科學版),2006;27(4):365-8.