miR-183對小鼠學習記憶的影響及作用機制

林培珺　王　鵬　陳　靜　向東方　毛高峰　

(武漢市精神衛生中心抑郁病房，湖北　武漢　430000)

1解放軍161醫院神經內科

微小RNA(miRNAs)在進化上高度保守，且不編碼蛋白，可通過與其特異性的靶mRNA結合，降解或抑制蛋白的翻譯，從而對基因的表達進行調控〔1〕。中樞神經系統也有多種miRNA表達，且一些miRNA特異性在腦組織的各個亞區表達〔2〕。大量研究顯示，特異性的miRNA影響神經系統樹突生長、神經發生、樹突棘形態等生理過程〔3～5〕。miR-183基因簇存在于多數的后口動物中，是一個高度保守的基因簇，有研究顯示，在人和小鼠的大腦皮質中有miR-183的特異性表達，參與大腦皮層發育及神經細胞分化的調控，但miR-183對學習記憶的影響研究尚不清楚〔6〕。本研究在小鼠大腦海馬齒狀回注射miR-183的抑制試劑鎖核酸(LNA)-miR-183，Morris水迷宮檢測小鼠的行為學變化，并檢測記憶相關蛋白突觸后致密蛋白(PSD95)、NR2B、NR1的蛋白表達。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器Trizol購自美國Invitrogen；熒光定量試劑盒及反轉錄試劑盒購自日本Takala；LNA抑制探針購自美國EXIQON；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Morris 水迷宮及記錄儀購自中國泰盟；腦立體定位儀購自中國瑞沃德。

1.2實驗動物C57/BL Wild-Type 2月齡雄性小鼠由武漢大學動物實驗中心提供，小鼠繼續飼養至3～4月齡用于實驗研究。飼養期間每籠限制個數，按照12 h的黑暗交替規律作息。采取自由飲水和采食。動物處理按照1995年神經科學協會的《動物使用政策》的規章制度執行。

1.3miR-183在小鼠海馬中的表達冰上分離雙側海馬，大約25 mg，Trizol法提取海馬中的總RNA，紫外分光光度計根據OD260 nm/280 nm值確定RNA的純度和濃度，取2 μg的總RNA，根據逆轉錄試劑盒的操作說明反轉錄總RNA為cDNA，以cDNA為模板，以U6作為內參基因，利用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測miR-183的mRNA表達。利用2-△△Ct法對各樣品的Ct值進行基因的表達分析。

1.4抑制miR-183后小鼠的行為變化水迷宮實驗檢測小鼠的學習記憶能力。首先采用立體定位技術在小鼠大腦海馬齒狀回注射miR-183的抑制試劑LNA-miR-183，同時設置生理鹽水為陰性對照及無關對照LNA-Scramble，72 h后檢測相應的行為學變化。

1.5Western印跡脫臼處死小鼠，分離出全腦，預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌腦表面的血跡，置于冰上小平皿上快速分離出雙側的海馬，放入已干凈的離心管中，勻漿離心后取上清，BCA法測定蛋白的濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液按照1∶10比例充分混勻，置于100℃煮沸變性10 min，取等量蛋白樣品依次進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離、聚偏氟乙稀(PVDF)轉膜、5%脫脂奶粉封閉，分別加入PSD95、NR2B、NR1(均按照1∶500稀釋)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，1∶1 000稀釋)一抗，4℃過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌(3次×10 min)，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，化學增強發光法(ECL)顯色，顯影后采用Gel-Pro analyzer分析各個條帶的光密度，以GAPDH作為內參蛋白，分析PSD95、NR2B、NR1的蛋白相對表達量。

1.6統計學方法應用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2　結　果

2.1海馬和皮質中miR-183的表達小鼠海馬和皮質中miR-183 mRNA表達(0.71±0.08，0.62±0.06)均顯著低于對照組(1.00±0.05，P<0.01)。

2.2抑制內源性miR-183對小鼠學習記憶能力的影響對照組、LNA-Scramble組和LNA-miR-183組在1 d的潛伏期分別為(79.2±0.07)、(78.2±0.11)、(77.1±0.26)s，2 d的潛伏期分別為(58.8±2.69)、(56.8±2.83)、(61.2±3.23)s，3 d的潛伏期分別為(46.2±3.21)、(46.0±3.45)、(48.9±3.11)s，4 d的潛伏期分別為(42.1±4.12)、(41.5±4.09)、(44.6±4.03)s，5 d的潛伏期分別為(38.8±4.06)、(37.2±3.98)、(46.8±3.46)s，6 d的潛伏期分別為(24.3±3.21)、(26.8±3.18)、(42.9±3.65)s，平臺通過次數分別為(4.1±0.43)、(4.3±0.41)、(1.9±0.32)次，與對照組比較，LNA-miR-183組小鼠訓練階段的潛伏期延長，記憶檢測階段時穿越平臺位置的次數也明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3抑制內源性miR-183對PSD95、NR2B、NR1蛋白表達的影響對照組、LNA-Scramble組和LNA-miR-183組PSD95的蛋白表達分別為(0.514±0.042)、(0.507±0.041)、(0.161±0.024)，NR2B的蛋白表達分別為(0.142±0.019)、(0.148±0.020)、(0.091±0.012)，NR1的蛋白表達分別為(0.358±0.032)、(0.361±0.033)、(0.082±0.011)，LNA-miR-183組均顯著低于對照組(P<0.01)。見圖1。

圖1　抑制內源性miR-183對PSD95、NR2B、NR1蛋白表達的影響

3　討　論

目前已發現多種表達異常的miRNA可能與學習記憶的發生有關〔7〕。有研究顯示，miR-183可參與帕金森病的發生〔8〕。關于miR-183基因對學習記憶的影響尚不清楚。

Morris水迷宮是檢測海馬依賴最經典的方法。PSD95是在谷氨酰胺能突觸后的致密區中發現的特殊蛋白質，可參與突觸鏈接的維持和形成，在整合和介導N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體信號轉導中發揮關鍵作用。有研究顯示，PSD95基因的敲除可引起小鼠學習記憶功能及長時程增強的改變〔9〕。NMDA受體由NR(1～3)3種亞甲基組成，NR2又分為NR2A、NR2B、NR2C、NR2D，NR2B是NMDA受體發揮作用不可缺少的亞基之一，被稱為“聰明的基因”，可以多種方式影響學習記憶和突觸的可塑性〔10〕。本研究結果提示，抑制內源性miR-183表達可損傷學習記憶能力，可能與PSD95、NR2B、NR1的蛋白表達下調有關。

1Eichhorn SW,Guo H,McGeary SE,etal.mRNA destabilization is the dominant effect of mammalian microRNAs by the time substantial repression ensues〔J〕.Mol Cell,2014;56(1):104-15.

2Cheung IY,Farazi TA,Ostrovnaya I,etal.Deep MicroRNA sequencing reveals downregulation of miR-29a in neuroblastoma central nervous system metastasis〔J〕.Genes,2014;53(10):803-14.

3Cheng TL,Wang Z,Liao Q,etal.MeCP2 suppresses nuclear microRNA processing and dendritic growth by regulating the DGCR8/Drosha complex〔J〕.Dev Cell,2014;28(5):547-60.

4呂路,梅蕊,彭樊,等.Akt信號通路在非典型性抗精神病藥物阿立哌唑調節海馬神經細胞凋亡中的作用〔J〕.中國老年學雜志,2017;37(9):2110-2.

5Bicker S,Khudayberdiev S,Weib K,etal.The DEAH-box helicase DHX36 mediates dendritic localization of the neuronal precursor-microRNA-134〔J〕.Genes Dev,2013;27(9):991-6.

6McSweeney KM,Gussow AB,Bradrick SS,etal.Inhibition of microRNA 128 promotes excitability of cultured cortical neuronal networks〔J〕.Genome Res,2016;26(10):1411-6.

7Williamson VS,Mamdani M,McMichael GO,etal.Expression quantitative trait loci (eQTLs) in microRNA genes are enriched for schizophrenia and bipolar disorder association signals〔J〕.Psychol Med,2015;45(12):2557-69.

8Alsharafi W,Xiao B.Dynamic expression of microRNAs (183,135a,125b,128,30c and 27a) in the rat pilocarpine model and temporal lobe epilepsy patients〔J〕.CNS Neurol Disord Drug Targ,2015;14(8):1096-102.

9Takei Y,Kikkawa YS,Atapour N,etal.Defects in synaptic plasticity,reduced NMDA-receptor transport,and instability of postsynaptic density proteins in mice lacking microtubule-associated protein 1A〔J〕.J Neurosci,2015;35(47):15539-54.

10MacDougall G,Anderton RS,Edwards AB,etal.The neuroprotective peptide poly-arginine-12 (R12) reduces cell surface levels of NMDA NR2B receptor subunit in cortical neurons;investigation into the involvement of endocytic mechanisms〔J〕.J Mol Neurosci,2017;61(2):235-46.