秋梨膏對納米二氧化硅引起大鼠肝、腎毒性的防護(hù)作用

陸　敏　孫湖泊　李　妍　王長文　

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林　吉林　132013)

1北京體育大學(xué)附屬醫(yī)院

納米顆粒的粒徑極小，可以順利通過生物膜而進(jìn)入機體的組織細(xì)胞，并進(jìn)一步影響細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能，最終引起細(xì)胞代謝紊亂或基因表達(dá)異常〔1～3〕。Duan等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化硅是誘發(fā)心血管疾病的危險因素；龔春梅等〔5〕進(jìn)一步證實了納米二氧化硅對機體的毒性作用。本實驗擬檢測納米二氧化硅對大鼠肝、腎的影響及秋梨膏的干預(yù)效果。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組健康雄性Wistar大鼠，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物批準(zhǔn)號為2011-x-072。隨機將大鼠分為3組，每組8只，對照組采取灌胃生理鹽水及氣管滴注生理鹽水處理；染毒組灌胃生理鹽水，并給予氣管滴注納米二氧化硅，濃度10 mg·kg-1·bw-1；秋梨膏干預(yù)組在氣管滴注納米二氧化硅的同時，灌胃秋梨膏(0.225 ml/只)。每組大鼠均隔日氣管滴注，共進(jìn)行15次。非氣管滴注日進(jìn)行灌胃。處理結(jié)束后麻醉大鼠，并迅速取出肝及腎，稱重并逐項檢測。

1.2主要試劑秋梨膏，北京恩濟堂制藥有限公司生產(chǎn)；粒徑50 nm的納米二氧化硅購自阿拉丁生物制品有限公司；羥脯氨酸(HYP)試劑盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1抗體由美國Abcam生物科技公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3大鼠尿常規(guī)檢測各組大鼠處死時從膀胱抽取尿液，檢測尿隱血、亞硝酸鹽、尿膽原、尿膽紅素、尿葡萄糖等尿常規(guī)指標(biāo)。

1.4肝、腎組織HYP含量檢測準(zhǔn)確稱取肝、腎組織后，加入水解液中混勻，沸水浴水解，按照HYP含量測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，計算肝及腎組織中HYP含量。HYP的含量反映了組織中膠原纖維的含量，是特異性判斷組織早期纖維化相關(guān)性的重要指標(biāo)，Masson染色藍(lán)染的部分即為膠原纖維。

1.5免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)染色法檢測肝、腎細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá)情況。肝、腎組織切片后分別經(jīng)過抗原修復(fù)后按照免疫組織化學(xué)染色步驟進(jìn)行染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察切片。對照組細(xì)胞核呈藍(lán)色且深染，而表達(dá)陽性細(xì)胞的胞質(zhì)呈黃色或棕黃色，計數(shù)每個400倍視野下的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗、t檢驗、單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1大鼠尿常規(guī)指標(biāo)檢測硅染毒組大鼠尿隱血(6例)、尿膽原+(8例)、尿膽紅素+(8例)明顯高于對照組(均0例)，而秋梨膏干預(yù)可有效改善大鼠尿隱血(0例)及尿膽紅素(+0例)異常現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但秋梨膏對納米二氧化硅染毒大鼠的尿膽原(+8例)升高沒有緩解作用(P>0.05)。

2.2大鼠肝、腎組織蘇木素-伊紅(HE)染色結(jié)果顯微鏡下觀察對照組大鼠的肝組織切片，可見肝細(xì)胞的形態(tài)正常，細(xì)胞膜及核膜完整，中央靜脈形態(tài)正常。染毒組大鼠肝組織中可見淋巴細(xì)胞浸潤，形成肉芽腫，肝細(xì)胞出現(xiàn)水樣變性。與對照組大鼠腎組織相比，染毒組腎小管管腔因水腫而狹窄，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生水樣變性，腎小球充血。秋梨膏干預(yù)組大鼠的肝、腎病理變化與對照組相比均明顯減輕。見圖1。

圖1　秋梨膏對納米二氧化硅染毒大鼠肝、腎組織形態(tài)的影響(HE，×400)

2.3HYP含量檢測對照組、染毒組及秋梨膏干預(yù)組大鼠肝(103.57、92.52、86.22 μg/g)、腎(93.37、102.38、91.84 μg/g)HYP的含量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2　各組大鼠肝、腎Masson染色照片(Masson，×400)

2.4TGF-β1表達(dá)檢測秋梨膏干預(yù)組大鼠腎組織中TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)(143.50個)明顯高于對照組(1.50個)和染毒組(1.75個，P<0.01)，肝組織中(1.25個)與對照組(3.50個)和染毒組(0.75個)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3　各組大鼠肝、腎TGF-β1表達(dá)的免疫組化照片(×400)

3　討　論

細(xì)胞實驗結(jié)果表明，納米二氧化硅的粒徑及細(xì)胞的種類是影響其毒性的關(guān)鍵因素〔6〕。Rabolli等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化硅顆粒對J774巨噬細(xì)胞、EAHY926 內(nèi)皮細(xì)胞、3t3 纖維母細(xì)胞和人類紅細(xì)胞的毒性作用機制及毒性效應(yīng)并不相同。本研究結(jié)果表明，納米二氧化硅可引起大鼠肝、腎細(xì)胞的明顯水腫，提示一定粒徑的納米二氧化硅對肝腎組織均有損傷作用。

秋梨膏是我國一直廣泛使用的傳統(tǒng)藥膳膏劑，其潤肺止咳、清熱化痰的效果受到廣大人民群眾的普遍認(rèn)可，但秋梨膏的藥理作用目前尚未完全闡明。本實驗結(jié)果表明，秋梨膏可明顯抑制大鼠尿隱血及尿膽紅素異常增高現(xiàn)象，并明顯緩解納米二氧化硅對肝、腎組織的毒性作用，減輕肝腎細(xì)胞損傷。另外與對照組相比，毒組及秋梨膏干預(yù)組大鼠肝、腎組織中膠原纖維含量均未發(fā)生變化，這可能是因為納米二氧化作用時間較短，并未引起病變組織中膠原纖維的代償性增加。

TGF-β家族成員包括TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3。研究表明〔8〕，TGF-β在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡、免疫等方面具有重要的生物學(xué)作用。其中，TGF-β1主要由內(nèi)皮細(xì)胞和結(jié)締組織產(chǎn)生，是組織損傷及器官修復(fù)過程中的核心調(diào)控分子。本實驗結(jié)果說明給予秋梨膏可能誘導(dǎo)大鼠腎組織中TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的過量表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，納米二氧化硅可引起大鼠肝、腎組織的明顯損傷，秋梨膏可有效抑制納米二氧化硅的毒性作用，但秋梨膏對納米二氧化硅引起的肝、腎組織損傷調(diào)控機制有所不同，其具體的分子機制有待深入研究。

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3Lu CF，Yuan XY，Li LZ，etal.Combined exposure to nano-silica and lead induced potentiation of oxidative stress and DNA damage in human lung epithelial cells 〔J〕.Ecotoxicol Environ Saf，2015；122：537-44.

4Duan J，Yu Y，Yu Y，etal.Silica nanoparticles induce autophagy and endothelial dysfunction via the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway 〔J〕.Int J Nanomedicine，2014；5(9)：5131-41.

5龔春梅，楊亞蕊，周繼昌，等.維生素E對納米二氧化硅誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 〔J〕.職業(yè)與健康，2016；32(7)：902-5.

6Sohaebuddin SK，Thevenot PT，Baker D，etal.Nanomaterial cytotoxicity is composition，size，and cell type dependent 〔J〕.Part Fibre Toxicol，2010；7(1)：22.

7Rabolli V，Thomassen LC，Princen C，etal.Influence of size，surface area and microporosity on the in vitro cytotoxic activity of amorphous silica nanoparticles in different cell types 〔J〕.Nanotoxicol，2010；4(3)：307-18.

8Scharf JG，Braulke T.The role of the IGF axis in hepatocarcinogenesis 〔J〕.Horm Metab Res，2003；35(11-12)：685-93.