運動對增齡性大鼠骨骼肌TGF-β/Smad信號通路的作用

虎　力　溫佩彤　高　原　張偉波　徐　平　

(上海中醫藥大學針灸推拿學院，上海　201203)

衰老性肌萎縮(SA)，也稱增齡性骨骼肌萎縮，伴有骨骼肌質量及力量下降，增加摔倒、骨折風險，危害老年人健康〔1〕。研究表明〔2〕，衰老骨骼肌衛星細胞的密度及再生能力下降能夠延長肌肉損傷的恢復。衰老過程中肌肉衛星干細胞異常分化與纖維化和脂肪沉積有關〔3〕。轉化生長因子(TGF)-β是重要的促纖維化形成的細胞因子，對細胞分裂、增殖具有促進或抑制的雙重作用〔4〕。研究表明，抗阻運動或長時間耐力運動對預防SA有良好效果〔5〕。本研究探討運動對TGF-β/Smad信號通路的作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物分組6月齡雄性SD大鼠，36只，體重(420±20)g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心(SPF級)。適應性飼養1 w后，將大鼠隨機分為18月齡空白(YC)組、18月齡運動(YE)組、20月齡空白(AC)組、20月齡運動(AE)組、22月齡空白(JC)組、22月齡運動(JE)組，每組各6只。

1.2動物模型建立大鼠自6月齡起給予自由飲水和飲食，室溫(23±1)℃，相對濕度(50±5)%，光照明、暗各12 h。飼養至12月齡開始跑臺運動。實驗前各組大鼠反應良好，毛發光滑、色白，行動敏捷。

1.3干預措施空白組：YC、AC、JC組為基礎數據對照，不運動，只選擇與運動組相同的時間點練習抓取動作。運動組：YE、AE、JE組采取運動干預，各組的運動周期為：YE 12～18個月，AE 12～20個月，JE 12～22個月。參照Bedford等〔6〕的運動方案，起始速度15 m/min，持續2 min×6次，兩次運動之間休息2 min，坡度均為0，隔日1次，3 w后休息1 w。

1.4標本取材各組分別于處理因素結束，待大鼠休息24 h后，采用10%的水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉，迅速取比目魚肌、腓腸肌稱重，一部分用錫紙包裹標記后立即置于液氮中，另取一部分置于4%多聚甲醛溶液制備石蠟切片。通過心臟取血采集全血5 ml，常溫靜置1 h，離心(3 000 r/min)15 min，分離上層血清，用于檢測丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)活性。待所有標本收集完成后立即置于-80℃超低溫冰箱備用。

1.5指標檢測①每天觀察各組大鼠的飲食、毛發及精神活動狀態，肌肉獲取前稱量體重，計算肌肉濕重與體重之比。②依據試劑盒說明(南京建成抗氧化檢測試劑盒)檢測血清SOD、MDA含量。③采用常規石蠟切片，對比目魚肌進行蘇木素-伊紅(HE)染色；采用OLYMPUS CX21型光學顯微鏡觀察骨骼肌形態；采用Leica IM50 image manager V1.20分析軟件對切片進行抓圖、存儲與分析。④采用常規Western印跡法檢測骨骼肌蛋白表達，包括：與骨骼肌纖維化相關的信號蛋白TGF-β/Smad2/p-Smad2/Smad3/p-Smad3；與骨骼肌降解相關的信號蛋白肌肉萎縮盒F蛋白(Atrogen)/肌肉特異性環指蛋白(MuRF)/肌肉生長抑制素蛋白(MSTN)。

1.6統計學方法應用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1行為學觀察YC及YE組已出現毛色發黃、脊背部體毛枯疏無光澤，且存在不同程度的脫毛現象，尾部有色素沉著，活動相對減少，反應較為遲鈍，但飲食尚積極，AC、AE、JC、JE組上述表現更為明顯。

2.2各組體重與濕重及血清SOD、MDA水平比較YE、AE組體重較YC、AC組均有所下降，但比目魚肌和腓腸肌的濕重及濕重/體重均有所增加，但只有AE組比目魚肌濕重/體重較AC組差異有統計學意義(P<0.05)。JE組大鼠體重及比目魚肌、腓腸肌的濕重及濕重/體重均較JC組增加更為明顯，但只有JE組腓腸肌濕重較JC組差異有統計學意義(P<0.05)。YE與YC組、AE與AC組比較SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低(均P<0.05)；JE與JC組比較SOD水平有所增加，MDA水平有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組體重濕重及血清SOD、MDA值比較

與YC組比較：1)P<0.05，與AC組比較：2)P<0.05，與JC組比較：3)P<0.05；下表同

2.3各組比目魚肌形態比較YE組骨骼肌細胞排列整齊，大小均勻，細胞膜清晰，肌纖維排列整齊，YC組部分區域肌纖維排列較松散，肌纖維圓形化、肌細胞直徑大小不等，細胞外基質增多；與AC組相比，AE組肌纖維排列較為緊密，圓形化肌纖維和細胞核中心化現象相對少見；JC組大部分區域肌纖維排列較松散，且肌纖維大小、形態差異較大，部分肌纖維邊界圓潤，出現較多圓形化的肌纖維；JE組肌纖維排列較JC組緊密，圓形化肌纖維和細胞核中心化現象存在。見圖1。

圖1　各組比目魚肌橫切面圖(HE，×400)

2.4各組TGF-β/Smad通路信號蛋白表達情況比較與YC相比，YE組Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3表達均增加，但只有Smad2、Smad3水平差異有統計學意義(P<0.05)。與AC組相比，AE組上述信號蛋白表達均有所下降，但只有Smad2水平差異有統計學意義(P<0.05)。與JC組比較，JE組Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3水平均顯著降低(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2　各組TGF-β/Smad通路信號蛋白表達情況

組別Smad2p?Smad2Smad3p?Smad3YC組0．68±0．280．71±0．060．45±0．090．61±0．12YE組0．99±0．221)0．72±0．120．64±0．161)0．70±0．10AC組0．41±0．280．85±0．270．55±0．130．70±0．20AE組0．25±0．152)0．72±0．300．40±0．140．53±0．14JC組0．81±0．121．11±0．171．06±0．351．86±0．82JE組0．73±0．373)0．89±0．193)0．74±0．533)1．49±0．643)

2.5各組骨髓肌降解相關信號蛋白表達情況比較YE組TGF、MSTN、Atrogen、MuRF水平均較YC組升高，但差異無統計學意義(P>0.05)。AE組較AC組上述指標均下降，但只有MSTN、Atrogen差異有統計學意義(P<0.05)。JE組上述指標均較JC組顯著下降(均P<0.05)。見圖3、表3。

圖3　各組骨骼肌降解相關信號蛋白表達

組別TGFMSTNAtrogenMuRFYC組0．41±0．180．64±0．010．63±0．330．44±0．16YE組0．61±0．310．71±0．130．80±0．420．65±0．2AC組0．31±0．220．56±0．120．55±0．150．65±0．13AE組0．29±0．250．46±0．090．42±0．212)0．39±0．092)JC組1．26±0．471．70±0．041．26±0．561．41±0．26JE組0．89±0．483)0．96±0．253)0．67±0．193)1．18±0．413)

3　討　論

SOD是體內清除自由基的重要抗氧化酶，MDA是細胞自由基損傷程度的指標之一〔7〕，本研究提示運動減緩SA與調節機體氧自由基代謝有關。并且運動能夠延緩增齡所致的大鼠骨骼肌衰老的進程。

研究表明，衰老過程伴隨骨骼肌纖維化加重〔4〕，骨骼肌纖維化的實質是細胞外基質的過度集聚，導致細胞外基質的纖維化從而形成機械屏障，阻礙細胞的遷移和融合，干擾肌纖維的再生〔8〕，而TGF-β是重要的促纖維化形成的細胞因子。研究表明〔9〕，骨骼肌纖維化是骨骼肌慢性疾病和外傷的病理性標志之一，大量的肌纖維化會干擾肌纖維的再生及收縮功能的恢復。MSTN對骨骼肌的發育和再生具有明顯的負性調節作用〔10〕，本研究提示運動后期(20～22月齡)能夠降低骨骼肌的纖維化。

運動干預前期(12～18月齡)骨骼肌的纖維化相對增加，而運動后期(20～22月齡)骨骼肌纖維化程度又相對降低，并伴有骨骼肌質量的顯著增加，可能原因為正常骨骼肌重量的維持需要蛋白合成與降解之間的平衡，肌萎縮最終都會導致蛋白含量的改變，而蛋白質合成減少和(或)分解增加是導致骨骼肌重量減少的重要原因〔11〕。研究表明〔12〕，骨骼肌在萎縮狀態下泛素蛋白酶通路被激活。骨骼肌蛋白降解主要包括溶酶體、泛素-蛋白酶體(UPS)和Ca2+依賴性3種途徑。其中，UPS途徑是生物體最主要的蛋白降解系統，主要由泛素、泛素相關酶和蛋白酶體3部分組成，在多種蛋白質的降解過程中發揮著重要作用，并具有高度的特異性。在肌萎縮時Atrogen-1和MuRF-1蛋白顯著激活〔12〕，而Atrogen-l、MuRF-1這兩個基因與骨骼肌蛋白降解密切相關，被認為是與骨骼肌蛋白降解有關的特異性基因〔12〕。研究表明〔13〕，被動運動能夠明顯降低失神經骨骼肌萎縮中MuRF-1蛋白和mRNA表達水平。耐力訓練和抗阻訓練后，大鼠腓腸肌MuRF-1、Atrogen和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 mRNA表達顯著降低〔14〕。由此推斷，運動減緩SA的進程，可能與運動干預后期降低骨骼肌纖維化和(或)降低骨骼肌蛋白降解有關。

綜上所述，本研究從骨骼肌纖維化及骨骼肌蛋白降解的角度，探討了運動減緩不同月齡增齡性SD大鼠骨骼肌萎縮的作用及其分子機制，認為運動能夠減緩SA的進程，其機制可能與運動后期降低骨骼肌的纖維化和(或)減少骨骼肌蛋白降解有關。

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