維吾爾族及漢族帕金森病患者ATP13A2基因Ala1144Thr突變比較

李桂花　夏　歡　楊新玲　

(新疆醫科大學附屬第二醫院神經中心，新疆　烏魯木齊　830000)

1新疆醫科大學附屬腫瘤醫院

研究認為，基因突變不僅是家族性帕金森病(FPD)的致病因素，在散發性帕金森病(SPD)患者中也可出現致病基因的突變〔1〕。研究也證實帕金森病(PD)相關基因的基因多態性與SPD患病風險有關〔2〕。ATP13A2基因目前研究認為是PD發病的易感致病基因，在早發性PD(EOPD)和FPD 患者中均可發現 ATP13A2 基因突變〔3〕。Ala1144Thr位點目前是ATP13A2基因研究最新的位點之一，但目前尚缺乏相關研究報道。新疆地處中亞，世代居住于該地區的維吾爾族(簡稱維族)相比漢族具有遺傳背景的差異性，故該研究在本課題組前期工作的基礎上，探討ATP13A2基因位點Ala1144Thr位點突變及多態性與新疆地區維吾爾族和漢族人群SPD發病(尤其是早發性)的相關性。

1　對象與方法

1.1研究對象選擇2012年8月至2015年3月收集來自于新疆伊犁地區、和田地區、烏魯木齊市流行病學調查及就診于新疆醫科大學第一附屬醫院的長期生活在新疆地區(2代以上)、未與其他民族通婚的維族及漢族原發性PD患者，正常對照組為同期流調中及來自新疆醫科大學第一附屬醫院的生活環境、飲食習慣和受教育程度與PD患者相似，性別、族別相同，年齡相差不超過5歲，且家族中無PD家族史的健康體檢者。PD組420例，男245例，女175例；維族200例，漢族220例；以50歲為界分為EOPD組和遲發性PD(LOPD)組，EOPD組101例，LOPD組319例；正常對照組400例，男208例，女192例；維族198例，漢族202例；≤50歲者110例；>50歲者290例。兩組年齡、性別比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2實驗方法獲得患者知情同意后，抽取外周靜脈血2 ml置于含800 μl乙二醇四乙酸的抗凝管中，使用天根生化(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，嚴格按照試劑盒配套說明操作書操作。檢驗DNA純度在1.7～1.9，濃度≥10 ng/Bul,判為DNA純度合格。樣本-20℃保存，備用。引物設計參照文獻由上海生工公司合成，Ala1144Thr位點：上游引物：5′-GCAGGGAGTTCCAGTGTCTG-3′。下游引物：5′-GGTCTGGTCACCCTCAACTTC-3′；聚合酶鏈反應(PCR)體系共20 μl:2×Qat PCR Master Mix 10 μl,10 μmol/ml上下游引物各0.5 μl,100 ng/μl DNA 2 μl,去離子水補至20 μl。PCR反應條件：94℃預變性3 min，經過25個循環(94℃變性30 s，60.3℃退火30 s，72℃延伸30 s)，最后72℃延伸7 min，保存于4℃，PCR產物為323 bp。

1.3統計學方法使用SPSS17.0統計軟件進行χ2檢驗和Fisher精確檢驗。

2　結　果

2.1ATP13A2基因Ala1144Thr位點PCR擴增及直接測序結果Ala1144Thr多態位點基因型分為野生型CC型，純合變異TT型和雜合變異CT型，應用PCR擴增產物直接測序的方法，在420例SPD患者和400例正常對照組中，僅發現1例男性維吾爾族PD患者(42歲，病程4年)發生雜合CT基因型變異，且這例PD患者是EOPD患者，未發現有純合變異TT基因型。所有漢族SPD患者和正常對照組未均未發現雜合變異CT基因型和純合變異TT基因型。ATP13A2基因Ala1144Thr位點經PCR 擴增后產物片段的理論值為323 bp，在2.0 %瓊脂糖凝膠上電泳可顯示該PCR的擴增產物，見圖1。ATP13A2基因Ala1144Thr位點直接測序圖：Ala1144Thr多態基因型以CC野生型為主，雜合子變異CT基因型極少，未發現有純合子變異TT基因型。直接測序結果見圖2所示(SNP位點反向測序圖，圖中箭頭所指為堿基替換處)：上圖為CC型；下圖為CT型；從下圖可以看出從左向右第5個本來是C的，結果突變成了T，測序結果為雜合變異，雙峰圖。

1～7：PCR擴增產物電泳圖圖1　Ala1144Thr PCR擴增產物電泳圖

上圖:CC型；下圖:CT型圖2　Ala1144Thr位點直接測序圖

2.2ATP13A2基因Ala1144Thr位點基因型及等位基因頻率比較

2.2.1PD組與正常對照組Ala1144Thr位點基因型及等位基因頻率比較ATP13A2基因Ala1144Thr位點在PD組和正常對照組基因型頻率及等位基因型頻率分布比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　不同年齡、不同性別新疆維吾爾族及漢族PD與正常對照組Ala1144Thr基因型及等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.2.2不同年齡、不同性別新疆維吾爾族及漢族PD與正常對照組Ala1144Thr基因型及等位基因頻率比較Ala1144Thr基因型及等位基因型頻率在男性PD組與女性PD組，男性PD組與男性正常對照組，女性PD組與女性正常對照組，EOPD亞組與LOPD亞組，EOPD亞組與≤50歲正常對照組，LOPD亞組與>50歲正常對照組，EOPD亞組男性組與EOPD亞組女性組，LOPD亞組男性組與LOPD亞組女性組之間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2.3不同民族PD與對照組Ala1144Thr基因型及等位基因頻率比較Ala1144Thr位點基因型頻率及等位基因頻率在維族PD與漢族PD，維族PD與維族正常對照組，漢族PD與漢族正常對照組，維族EOPD亞組與漢族EOPD亞組，漢族EOPD亞組與≤50歲漢族正常對照組，維族EOPD亞組與≤50歲維族正常對照組，維族LOPD亞組與漢族LOPD亞組，漢族LOPD亞組與>50歲漢族正常對照組，維族LOPD組與>50歲維族正常對照組各個組之間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3Ala1144Thr位點不同基因表型(野生型CC與雜合變異CT型)PD患者臨床資料比較在420例SPD患者和400例正常對照組中，Ala1144Thr位點發生雜合突變CT基因型的僅有1例EOPD患者，這1例EOPD患者基本情況及量表測評結果如下，野生CC基因型SPD患者共419例，由于變異樣本量極少，故不同基因表型PD臨床資料方面對比無法得出有統計學意義的結論。

3　討　論

ATP13A2基因位于1號染色體上，共編碼29個外顯子，Ala1144Thr位點位于1號染色體上第28號外顯子上，Ala1144Thr多態性位點為C→T轉換，丙氨酸被蘇氨酸代替(Ala→Thr)。到目前為止，ATP13A2基因的研究熱點主要集中在該基因位點突變與PD的相關性方面，但研究結果表明ATP13A2基因突變率極低，且僅發生在某些特殊種類的PD患者中〔4〕。本研究僅發現1例維吾爾族PD患者發生Ala1144Thr位點雜合變異CT基因型，且這例PD患者為EOPD患者，該患者焦慮、抑郁、震顫、平衡障礙程度均較為嚴重，但由于變異樣本量少，與野生CC基因型的SPD患者無法做比較，故今后研究仍需繼續擴大樣本量進行相關研究。Ala1144Thr位點突變率在本研究中的SPD患者中占0.24%，與目前研究認為的ATP13A2基因突變總體頻率較低結果基本一致。但因目前國內外缺乏關于Ala1144Thr位點突變的相關報道，本研究結果尚需繼續擴大樣本量，重復驗證，減少假陽性和假陰性可能，以找出真正與PD發病相關的易感基因多態及突變位點。

維吾爾族與漢族存在不同的社會遺傳背景，研究結果表明ATP13A2基因Ala1144Thr位點基因型及等位基因型頻率在這兩個民族間可能存在較小的差異性；分析其原因考慮雖然不同民族間其遺傳結構可能存在不同，但由于不同民族人群長期所處環境相同，期間一些生活習慣的彼此融合，不可避免的都或多或少對基因有所影響，基因多態性分布可以趨向于差異減小。ATP13A2基因位點Ala1144Thr基因型及等位基因型頻率多態性可能與性別及年齡關系也不顯著。Ala1144Thr多態性與性別及年齡的關系目前國內外尚缺乏相關報道，仍需繼續擴大樣本量進一步研究該位點多態與PD性別及年齡的關系。不同于FPD，占絕大數量的SPD病因上很大程度仍不清楚，只有基于流行病學數據統計的遺傳易感性的報道。但是應該指出的是，PD的基因數據的報道提示沒有單一的常見基因多態能夠改變PD發病風險〔5，6〕。選擇基因同質人群、進行表型分析和謹慎的分析解釋數據以確保這些研究的正確發展。

1Park JS,Mehta P,Cooper AA.Pathogenic effects of novel mutations in the P-type ATPase ATP13A2(PARK9)causing Kufor-Rakeb syndrome,a form of early-onset parkinsonism〔J〕.Hum Mutat,2011;32(12):956-64.

2Ning YP,Kanai K,Tomiyama H,etal.PARK9-linked parkinsonism in eastern Asia:mutation detection in ATP13A2 and clinical phenotype〔J〕.Neurology,2008;70(12):1491-3.

3Xiromerisiou G,Dardiotis E,Tsimourtou V,etal.Genetic basis of Parkinson disease〔J〕.Neurosurg Focus,2010;34(4):28-9.

4Mao XY,Burgunder JM,Zhang ZJ,etal.ATP13A2 G2236A variant is rare in patients with early-onset Parkinson′s disease and familial Parkinson′s disease from Mainland China〔J〕.Parkinsonism Relat Disord,2010;16(2):235-6.

5Crosiers D,Ceulemans B,Meeus B.Juvenile dystonia-parkinsonism and dementia caused by a novel ATP13A2 frameshift mutation〔J〕.Parkinsonism Relat Disord,2011;17(1):135-8.

6Martin I,Dawson VL,Dawson TM.The impact of genetic research on our understanding of Parkinson′s disease〔J〕.Prog Brain Res,2010;183(1):21-4.